Miglioramento genetico

Miglioramento genetico specie autogame

Moltiplicazione vegetativa in vitro

Moltiplicazione vegetativa in vitro (clonazione): è possibile rigenerare una pianta da singole cellule differenziate, tranne da quelle che hanno perso il nucleo (tracheidi, del libro).

• A partire da meristemi: serve a risanare le colture che sono o rischiano di essere affette da virus, dal momento che le cellule meristematiche sono esenti da virus poiché continua la divisione mitotica.
• A partire dall’apice vegetativo: si effettua se la coltura è esente da virus.
• A partire da internodi.
• A partire da cotiledoni.

Morfogenesi diretta = da cellule differenziate di tessuto, senza proliferazione di tessuto indifferenziato.

Morfogenesi indiretta = da cellule de-differenziate di callo, cioè proliferazione di tessuto indifferenziato. Non più usato poiché causa mutazioni dovute alla divisione incontrollata di cellule.

Callo = tessuto vegetale che si forma intorno ad una ferita, è una massa di tessuto amorfo formato da cellule che si moltiplicano in maniera disorganizzata.

Micropropagazione = clonazione in vitro => permette d’ottenere un elevato n° di piante identiche sia genotipicamente che fenotipicamente alla pianta madre.

Lo scopo del miglioramento genetico è quello di ottenere individui tutti geneticamente uguali, con tutti i vantaggi e gli svantaggi che porta l’uniformità genetica, che è l’obiettivo del miglioramento genetico.

L’uniformità genetica si ottiene mediante ripetute autofecondazioni, le quali portano ad una totale condizione di omozigosi. Attraverso una continua autofecondazione si arriva all’ottenimento di linee omozigotiche e quindi alla formazione di linee pure.

L’autofecondazione avviene naturalmente nella specie autogame, ad esempio frumento, pisello e ceci; queste specie si clonano attraverso il seme, andando a produrre individui geneticamente identici. Quando vediamo un campo di grano, tutte piante uguali perché geneticamente uguali, che presenta piante meno alte, sarà dovuto a fattori ambientali.

Linee omozigoti e autofecondazione

Quante linee omozigoti si possono ottenere? Il n° di linee omozigosi = n° gameti prodotti in F1 (2ⁿ).

Es.) n = 5 loci eterozigoti AaBbCcDdEe, 1 genotipo. n = numero geni in eterozigosi. In questo caso tutti e 5 i geni sono in condizione di eterozigosi.

↓

n = 5

Si ottengono 2ⁿ linee omozigotiche = 2⁵ = 32, cioè 32 linee e quindi 32 genotipi diversi.

Nel miglioramento genetico, in queste 32 linee si scelgono quelle che presentano gli alleli più favorevoli in modo da ottenere genotipi migliori rispetto a quelli di partenza.

L’effetto dell’autofecondazione sulla struttura genetica delle popolazioni è quello di portare gli individui, nel corso delle varie generazioni, in condizione di totale omozigosi.

Nell’esempio sopra, è stato preso in considerazione 1 singolo gene; in realtà, quando si fa miglioramento genetico si considera un n° più elevato di geni, anche fino a 100 geni che segregano in maniera indipendente. Già dopo 10-12 generazioni di autofecondazione, arriviamo al 100% di omozigosi a tutti i loci.

(grafico)

Lavorare su specie autogame è quindi piuttosto semplice poiché la riproduzione per autofecondazione ci aiuta.

L’unica difficoltà è nel fare gli incroci poiché ogni pianta avrà entrambi i fiori maschili e femminili e quindi per selezionare i caratteri che c’interessano su 2 individui diversi, quindi incrociarli.

Es. Grano:

• Spiga 1: tagliare le antere immature, che contengono il polline.
• Spiga 2: polline da utilizzare.
• Unire le 2 spighe in un sacchetto.

Generazioni di autofecondazione

Come calcolare la quota di genotipi omozigoti, a tutti i loci, ad ogni generazione d’autofecondazione, con segregazione indipendente tra i geni.

Sarebbe la % di ottenere omozigoti ad ogni generazione.

Considerando 1 singolo gene:

• La quota d’eterozigosi si riduce del 50% ad ogni generazione d’autofecondazione.

Es.) F1 => eterozigosi (100%) a m = 0, m = numero di generazioni: 1.

F2 => eterozigosi (50%) a m = 1: (1/2)¹.

F3 => eterozigosi (25%) a m = 2: (1/2)^m.

Fn => eterozigosi a m = n: (1/2)ⁿ.

La quota d’omozigosi sarà calcolata come: (1 - quota eterozigosi).

Considerando il n° di geni che segregano in modo indipendente, la quota di omozigosi a tutti i loci sarà:

N.B. Le specie autogame raggiungono rapidamente un’elevata quota d’omozigosi a tutti i loci, andando a costituire una linea pura, come si vede nel grafico.

Come calcolare le linee di omozigosi

Come calcolare le linee di omozigosi che si possono ottenere?

Se il n° di linee omozigosi è uguale al n° di gameti prodotti nella F1, 2ⁿ, con n = n° geni.

Es.) L’ibrido, diibrido, LlGg forma 4 tipi di gameti, 2²: [LG; Lg; lg; Lg] in proporzioni uguali. Le combinazioni di questi 4 gameti forniscono le 16 combinazioni genotipiche che spiegano il rapporto fenotipico [9:3:3:1], secondo il quadrato di Punnet.

N° linee omozigoti, genotipi omozigoti, per ciascun gene nella F1.

La frequenza con cui compare ogni linea d’omozigoti varierà in base al fatto che questi geni siano indipendenti o associati.

Se i geni sono indipendenti, ossia segregano indipendentemente e quindi vengono prodotti 4 gameti in proporzioni uguali, ossia avranno la stessa frequenza del 25% ciascuno.

P AAbb x aaBB: AABB, AAbb, aaBB, aabb.

↓

¼ ¼ ¼ ¼

F1 AaBb ricombinanti.

↓

Quando si arriva alla condizione d’omozigosi totale, le 4 linee d’omozigosi possibili saranno presenti in uguale frequenza, hanno la stessa possibilità di verificarsi.

• Quindi avrò una probabilità su 4, 25%, di trovare l’individuo omozigote ricombinante che sto cercando.
• Avrò un fenotipo atteso di 1:1:1:1, ossia 4 fenotipi diversi con la probabilità del 25% di manifestarsi.

Se i geni sono associati non segregano indipendentemente e sono localizzati sullo stesso cromosoma.

P AAbb x aaBB.

↓

F1 AaBb.

Gameti AB e ab, gameti ricombinanti; Ab e aB, gameti parentali. Se i geni sono associati, la distanza tra essi va a stabilire la % di gameti ricombinanti.

In questo caso il rapporto fenotipico della segregazione indipendente non viene rispettato. Se la % frequenza di ricombinazione è pari all’1%, stabilita in base alla distanza, si avrà:

Frequenza 0,5%, 49,5%, 49,5%, 0,5%; la frequenza di ricombinazione totale dei due gameti ricombinanti è 1%.

La probabilità di trovare l’individuo omozigote, ricombinante, che cerco è dello 0,5%, molto bassa se confrontata al 25% se i geni segregassero in maniera indipendente.

Dopo continue autofecondazioni, le frequenze con cui alla fine ottengo queste 4 linee pure saranno leggermente più alte per i ricombinanti. Questo perché ad ogni generazione di autofecondazione ci sono sempre degli eterozigoti che continuano a segregare.

Se A e B sono indipendenti, la selezione è molto più semplice, 1 su 4, mentre se sono associati sarà molto più complesso, 1 su 200; quindi sarà meno probabile trovare il ricombinante favorevole che sto cercando.

La formula 2ⁿ ci dice quanti sono i ricombinanti che si possono ottenere partendo da un eterozigote per n geni, ma non ci dice la frequenza con cui ogni ricombinante compare.

La frequenza con cui ogni ricombinante compare dipende da come questi geni sono situati sui cromosomi, ossia se segregano indipendentemente, quindi ogni singolo genotipo ha la stessa probabilità di verificarsi; se sono associati la probabilità che un genotipo ricombinante si manifesta diventa molto più bassa.

Quindi all’aumentare del numero dei geni ed all’aumentare dell’effetto di associazione tra geni il programma di miglioramento genetico diventa sempre più difficile. In caso di molti geni, 50, si procede per step. Si parte con il primo carattere, 10-15 geni, e miglioro per quel carattere, per poi passare ad altri. Si fa così perché la probabilità di trovare al primo colpo, per molti geni, il ricombinante migliore diventa quasi 0.

Il principio fondamentale di tutti i programmi di miglioramento genetico è che è inutile utilizzare dei materiali in cui non c’è variabilità genetica per i caratteri che c’interessano. Grazie alla variabilità genetica andiamo a scegliere i ricombinanti favorevoli.

La variabilità genetica è alla base della selezione, una linea omozigote ha variabilità genetica = 0. Dev’essere preservata per far fronte a emergenze immediate e future, banche del germoplasma conservano i semi – preservare le risorse genetiche.

Con il discorso dell’introduzione dell’ingegneria genetica non abbiamo più bisogno di trovare geni all’interno della categoria; per migliorare il grano non servirà prelevare geni favorevoli all’interno della famiglia delle graminacee, ma si potranno prelevare anche da qualsiasi altro DNA di altri organismi.

Esperimento di Johannsen

Variabilità genetica all’interno di una popolazione autogama, ossia sono presenti un insieme di linee pure diverse, omozigote.

Formulò l’equazione Vf = Vg + Va dove:

• Vf = variabilità fenotipica che si osserva.
• Vg = variabilità genetica.
• Va = variabilità dovuta all’ambiente.

Questa suddivisione tra Vg e Va è importante per i caratteri quantitativi, cioè controllati da molti geni, ad esempio produzione seme, altezza, diametro foglie, ossia tutti caratteri che hanno bisogno di essere misurati quantitativamente. Hanno anche l’effetto dell’ambiente.

Ogni gene ha un piccolo effetto sul carattere; se avesse un effetto grande, riusciremo a seguire la segregazione a singoli geni.

I caratteri qualitativi sono controllati da uno o pochi geni, sono i più semplici su cui fare selezione ed hanno un basso o nullo effetto ambientale.

Differenze fenotipiche nella popolazione dovute totalmente all’effetto genetico, ad esempio geni che regolano il colore dei fiori.

Vg misura della variabilità genetica che c’è tra le 2 diverse linee. La varianza, S², misura la variabilità che c’è in un carattere quantitativo.

La media non ci dà informazioni di quanto i singoli dati si discostano da essa.

La deviazione standard, s, ci dà un numero che ci quantifica quanto sono variabili due diverse popolazioni.

Ci permette di suddividere il range di variazione attorno alla media in diverse parti ed ogni parte viene identificata come 1 deviazione standard, S.

Si afferma che tutti i dati sono compresi nell’intervallo tra la media ± 3 S.

Si può avere due diverse popolazioni con la stessa media d’altezze ma avere variabilità diversa e questa si definisce attraverso una S.

La variabilità che c’è tra le linee per il carattere altezza piante non sarà dovuto solo al fattore genetico, Vg, ma ci sarà una porzione di essa dovuta all’effetto ambientale, Va.

Quindi è necessario capire quanto questa variabilità sia dovuta a fattori puramente genetici o quanto l’ambiente abbia avuto effetto sull’altezza.

Se questo dipende maggiormente da fattori ambientali, attraverso la selezione si farà difficoltà ad identificare i materiali da selezionare.

Ereditabilità di un carattere

Ereditabilità di un carattere, h²: si calcola attraverso il rapporto: varianza genetica/varianza fenotipica.

L’ereditabilità ci dice quanta della variabilità che si vede in campo sia dovuta a fattori genetici, quindi si prelevano con sicurezza le piante più basse per effettuare la selezione con successo.

Più il valore è alto e maggiormente la variabilità dipenderà da fattori genetici.

Molti caratteri animali hanno bassa ereditabilità, ad esempio i bovini vanno studiati, analizzati e selezionati su vasta scala in condizioni climatiche diverse, poiché i loro caratteri dipenderanno molto da quest’ultimo.

Carattere produzione di granella: ereditabilità molto bassa; i genetisti scompongono il carattere produzione lavorando sulle singole componenti della resa.

La formula di J. è alla base del calcolo di h².

Varianza fenotipica = media generale, c, + media di ogni singola linea, blocchi, + effetto delle annate + effetto delle località + effetto delle linee x anno + effetto delle linee x varietà + effetto anno x località + linee x anni x località + errore.

Di ogni linea si fa più repliche, per ogni varietà, al fine di ottenere un valore medio più attendibile al reale.

Blocchi: serve per avere una stima più precisa dell’effettivo valore medio di una linea per un carattere quantitativo, inoltre serve per differenziare l’effetto dell’ambiente tra blocchi diversi.

Si distribuiscono le n linee su ogni parcella, blocco o replica, in modo casuale e blocco diverso per ogni blocco.

1 2 3 4 5 6 7 8 9: blocco 1.

Si fa poi la media tra le linee e poi la varianza, scostamenti.

1 2 3 4 5 6 7 8 9: blocco 2.

Blocco 3.

Varianza fenotipica totale dovuta a fattori ambientali, varianza, + varianza tra blocchi + varianza tra linee + errore sperimentale non controllabile.

La varianza tra blocchi se non è effettuata o calcolata, andrà a finire nell’errore sperimentale, fattori ambientali, quindi la media totale risulterebbe meno attendibile.

Johannsen lavorò nel nord Europa con i piselli, in queste rigide condizioni climatiche, che non favorivano la disseminazione entomogama. La specie del pisello è strettamente autogama, avrebbe potuto avere una certa quota d’incrocio nel caso ci fosse stato un clima favorevole agli insetti.

Lavorò sulla varietà locale “princess” ed osservò che c’erano semi con una notevole variabilità nella grandezza; in quanto autogama dipenderà esclusivamente da fattori ambientali, in teoria.

J. costituì 19 linee pure a partire da questi 19 semi. Notò che il peso medio dei semi raccolti dalle varie linee rispettavano l’andamento crescente della grandezza del seme, quindi che ci fosse un’influenza di tipo puramente genetica.

Fece un altro esperimento prendendo le 2 linee più estreme, linea 1 e 19, e dai semi ottenuti dalle 2 linee, notò che c’era molta variabilità all’interno della linea.

La variabilità entro linea pura dipende solo da fattori ambientali.

All’interno della linea 1, stessa cosa fece per la 19, scelse il seme più grande e quello più piccolo e riproducendoli notò che i semi più grandi producevano semi più piccoli mentre quelli più piccoli producevano semi più grandi.

Pur essendoci queste differenze, il valore medio non cambiava. Tutti gli scostamenti da questo valore medio sono dovuti ad un effetto di tipo ambientale.

Quindi da questo esperimento si dedusse che la selezione entro linea non funziona, a differenza di quella tra linee.

La variabilità entro linea è uguale a 0 visto che gli individui sono omozigoti, geneticamente tutti uguali, e quindi le differenze fenotipiche che si riscontrano sono esclusivamente dovute all’ambiente.

J. introdusse un nuovo concetto: nei caratteri quantitativi non ci sarà solo un effetto genotipico, sul valore fenotipico totale, ma anche un effetto ambientale.

Nella selezione entro linea pura è inefficace perché non c’è variabilità genetica, nulla o molto ridotta; la variabilità genetica è presente tra linee.

Conclusioni dell’esperimento di Johannsen

• La variabilità genetica è confinata tra linee omozigoti.
• Le singole linee omozigoti non hanno variabilità genetica.
• La selezione entro linea è inefficace.
• Le linee pure dovrebbero rimanere stabili nel tempo.
• Solo la selezione tra linee è efficace.

V fenotipica totale = V genetica, varianza delle medie linee, + V ambientale totale.

h² ereditabilità = V genotipica, tra linee, / V fenotipica => Vg/Vg + V ambientale totale.

Nel momento in cui usiamo i blocchi, in cui le linee vengono posizionate in ordine casuale, noi andremo a scomporre V ambientale totale in V tra blocchi + V ambientale.

Quindi la formula sarà:

Vf tot = Vg, tra linee, + V tra blocchi + V ambientale ².

Dove V amb. ² < V amb. Tot.

Dove V amb tot = V amb. ² + V tra blocchi.

In questo caso l’ereditabilità sarà:

h² = Vg / Vg + V amb. ²; è stata eliminata quella porzione della V amb. Tot dovuta a fattori ambientali che si manifesterebbero se non avessimo strutturato le linee in blocchi.

In questo caso, con i blocchi, l’ereditabilità sarà più alta poiché va a diminuire la variabilità al denominatore.

Quindi abbiamo diminuito la variabilità dovuta a fattori ambientali, ma non del tutto; la variabilità sarà dovuta maggiormente a fattori genetici.

Le specie autogame se fossero strettamente autogame, quindi la variabilità fosse confinata tra linee, sarebbero destinate a rimanere immutate nel tempo, quindi con ogni linea riproduttivamente isolata dalle altre, le specie, nel medio e lungo periodo sarebbero destinate all’estinzione perché le condizioni ambientali cambiano ed una linea valida potrebbe non essere efficace e quindi deve cambiare la struttura genetica dalla popolazione per adattarsi al cambiamento delle condizioni ambientali. Quindi se ogni linea fosse separata