Guida pratica all'istologia: tecniche e colorazioni

In istologia, va utilizzato un approccio descrittivo che tenga conto di forma, rapporti (aspetti qualitativi) e dimensioni (aspetto qualitativo) delle cellule dei tessuti e dei tessuti propri, scegliendo i corretti parametri di scala. Nell'analisi di tessuti o cellule osservati col microscopio ottico, si tiene conto di dimensioni come decine o singoli micrometri (al limite 0.5 micron come il perossisoma), invece strutture subcellulari come microfilamenti, microtubuli o vescicole di endocitosi mediata da recettori vanno osservate con il microscopio elettronico, con potere dell'ordine dei nanometri.

Microscopia ottica e elettronica

La sorgente di fotoni è una lampadina o un led. I fotoni emessi sono inviati a un sistema di lenti, detto "del condensatore", in cui i raggi luminosi vengono concentrati in modo da illuminare e attraversare un preparato istologico. Questo deve essere sufficientemente sottile da essere attraversato dai fotoni, in quanto si può osservare solo in trasparenza. Un problema della microscopia è che opera solo in sezioni, ovvero con immagini bidimensionali e non tridimensionali. L'immagine che si forma è raccolta da un sistema di lenti dell'obiettivo (di caratteristiche diverse che incidono sulla risoluzione) per cui si ottiene un'immagine riflessa visibile o a occhio nudo, o con fotocamera, o con videocamera. Per questo motivo, nelle sezioni di tessuto bisogna inserire un contrasto. Al microscopio ottico il tessuto analizzato perde alcune componenti poiché per ottenere la sezione si fanno una serie di trattamenti:

1. Biopsia;

2. Vasetto con formalina;

3. Lavaggio con acqua corrente;

4. Passaggio in alcool denaturato;

5. Passaggio in cloroformio;

6. Passaggio in mezzo di inclusione.

Preparazione e colorazione dei tessuti

Con questi passaggi si perdono molecole a basso peso molecolare, per cui a seconda del liquido usato per fissare il tessuto (per evitare la putrefazione) si conservano alcune macromolecole, come proteine, polisaccaridi, lipidi nelle gocce lipidiche, acidi nucleici nel nucleo e nel citoplasma, come rRNA (se ci sono molti ribosomi liberi o legati al RE), ma non tRNA o mRNA, che non sono visibili al microscopio ottico. Siccome la caratteristica degli acidi nucleici è l'acidità, si sfrutta l'attrazione elettrostatica e quindi si usano coloranti con natura basica. La colorazione nucleare e dei ribosomi citoplasmatici quindi è data dal colorante basico, che lega macromolecole, per definizione basofile. Nelle colorazioni standard come colorante basico si usa l'ematossilina, sostanza blu-violacea che attribuisce questa stessa colorazione al nucleo (basofilia nucleare). Lo stesso citoplasma potrà presentare basofilia diffusa o concentrata a seconda che i ribosomi siano liberi o legati al RE.

Coloranti e ingrandimenti

Le proteine, che hanno soprattutto gruppi basici liberi, possono legare per legame elettrostatico un colorante acido; difatti si utilizza eosina, di colorazione rosa-rosso vivace, che quindi lega molecole acidofile, come le strutture ricche di proteine. È stata utilizzata come contrasto anche l'eosina, per colorare le proteine citoplasmatiche, ottenendo una colorazione aspecifica, a bassi costi ma che permette di visualizzare la struttura dell'organo. (L'ingrandimento osservato è di 100 perché ad un obiettivo 10x si è associato un oculare 10x, pertanto ingrandimento finale 10x10.) Per osservare meglio i particolari, non è utile aumentare l'ingrandimento dell'immagine, poiché la qualità di essa dipende dal potere di risoluzione, che a sua volta dipende dall'obiettivo. Infatti, osservando la stessa immagine, ma con obiettivo 40x, dunque con 400 ingrandimenti finali osserviamo non solo i nuclei, ma anche regioni eu- ed eterocromatiche ed eosinofilia disomogenea che può suggerire una differente distribuzione degli organelli.