Microrganismi probiotici: biotecnologie e applicazioni

Lezione 1

Koch e la scoperta dei microrganismi

Koch è un medico che ha teorizzato i suoi postulati che si posizionano in un’epoca in cui c’è stata la scoperta dei microrganismi e la correlazione tra essi e le patologie in modo più specifico; si vede quindi il microrganismo Metchnikoff come un qualcosa da eliminare. Nell’inizio del 900 ha scoperto i macrofagi e inoltre ha teorizzato per la prima volta la presenza di microrganismi in grado di prolungare la vita umana e dare un beneficio.

Interazione tra essere umano e microrganismi

L’essere umano/animale interagisce con i microrganismi e questa interazione avviene con la compartecipazione di diversi fattori:

• Genetici e biologici sia dell’uomo che microrganismo
• Fisici e ambientali, può essere anche considerato l’alimento
• Ecologici
• Politici, sociali ed economici

Gli organismi superiori (pluricellulari membri dell'olobionti: regno Plantae e Animalia) non possono esistere senza la compartecipazione dei microrganismi. L’ospite deve vivere per forza in associazione con i microrganismi e l’insieme dei due genera l’olobionte, che è un’unità ecologica singola. L’evoluzione agisce con la pressione selettiva sull’olobionte, ossia sia su microrganismi che su essere umano.

Olobionte e ologenoma

I microrganismi che si trovano nell’uomo non sono casuali, bensì specifici. C’è un’interazione tra ospite e microrganismi e l’evoluzione ha agito perché l’ospite sia affine al microbiota. L’olobionte è un super organismo ed è stato teorizzato inizialmente da Margulis, che ha teorizzato anche il concetto di ologenoma, ossia l’insieme del genoma dell’uomo ma anche del microbiota. Si sono sviluppate teorie olobiontiche ologenomiche.

Microbiota e microbioma

Microbiota indica tutte le cellule microbiche presenti e viventi in un habitat specifico. Nell’uomo abbiamo differenti microbiota, così come nei vari ambienti che non sono l’uomo.

Microbioma differente è che ha due possibili definizioni:

• Insieme dei geni e del materiale genetico del microbiota (somma dei geni di tutti i microrganismi in una nicchia ecologica)
• Ecosistema microbico nel suo complesso (tutte le cellule, metaboliti, interazioni, prodotti dei microrganismi di un ecosistema microbico)

Classificazione dei microrganismi

I microrganismi sono organismi viventi che appartengono principalmente a tre regni: Protista, Monera e Fungi; nella classificazione americana si aggiunge anche la classificazione Archaea e Bacteria (che appartengono entrambi ai Monera).

Gram-Gram - Gram + sono termini utilizzati per classificare i batteri. Tutti gli organismi viventi vengono definiti su un genere e su una specie, ed è la nomenclatura binomiale. La tassonomia (attività di dare nomi e raggruppare i microrganismi in taxa) non si limita a genere e specie, ma prevede diversi livelli tassonomici, ossia diversi raggruppamenti. In ogni ambito di microbiologia applicata il ceppo è molto importante; non si tratta di un livello tassonomico, ma è un insieme di cellule microbiche teoricamente originate da un’unica cellula genitrice con cui condividono lo stesso patrimonio genetico. Molte proprietà probiotiche sono applicabili al ceppo e non a livello tassonomico; il ceppo non deve avere mutazioni nel tempo. Nella stessa specie ci sono ceppi molto differenti da altri, fino ad avere un alto grado di biodiversità. Il phylum è molto usato nel mondo della descrizione degli ecosistemi in ecologia microbica.

Nell’uomo abbiamo diversi siti in cui i batteri si sviluppano e abbiamo diversi microbiota, con una differente quantità di batteri, ma anche con diverse divisioni in differenti percentuali. Nell’intestino ci sono 10¹³-10¹⁴ cellule batteriche.

Importanza dell'intestino umano

L’intestino umano è molto rilevante per la salute per alcuni motivi fondamentali, ossia si tratta della nostra finestra verso l’esterno di lunghezza molto elevata, inoltre c’è una separazione molto leggera verso l’esterno perché c’è un singolo strato di enterociti. L’intestino è un ambiente eterogeneo perché è fatto da diverse nicchie ed ecosistemi che sono diversi in termini di pH, ma anche di disponibilità di ossigeno e questi due aspetti da soli generano una differenza di microrganismi.

Probiotici e loro funzione

Quando i probiotici raggiungono l’intestino raggiungono un vero e proprio microbiota intestinale, che offre una serie di servizi all’uomo al punto tale da poter essere definibile come un organo. I microrganismi nell’uomo vivono con essi in uno stato di simbiosi e infatti, come visto nei topi, l’essere superiore non è in grado di svilupparsi in modo adeguato se non sono presenti (non sviluppa il sistema immunitario, ha problemi nella raccolta di vitamine, non ha protezione e inoltre va incontro a morte precoce). Le funzioni del microbiota intestinale nei confronti dell’uomo sono diversi:

• Fa effetto barriera
• Regola la maturazione del sistema immunitario
• Regolazione motilità intestinale
• Produzione di vitamine (K, B)
• Modulazione dell’effetto degli alimenti sull’ospite

Il ruolo del microbiota intestinale ha effetto principalmente sui carboidrati che sono prodotti dall’ospite stesso (mucina e sfingolipidi) ma soprattutto fibra alimentare (molecole introdotte con la dieta non digerite che raggiungono il colon); il risultato del metabolismo della fibra è la produzione di molecole tra le quali ci sono gli acidi grassi a corta catena (butirrato, propionato ed acetato).

Gli acidi grassi a corta catena sono il prodotto finale del catabolismo dei batteri intestinali; fibra = fonte di energia di carbonio, che viene usato per il metabolismo dei batteri intestinali che la fermentano dando come risultato la produzione di acidi organici attraverso la fermentazione.

Effetti dei probiotici sulla salute

Il microbiota intestinale media il ruolo degli alimenti con effetti sulla salute umana: ciò che introduciamo con la dieta raramente ha un effetto direttamente sulla dieta, ma avviene prima un metabolismo, molte molecole introdotte hanno un effetto sull’essere umano necessariamente mediato dal microbiota.

Con i probiotici noi agiamo in modo mirato sul microbiota, possiamo quindi modularlo ed avere un effetto finale sulla salute dell’ospite. È uno degli strumenti più efficaci per modificare il microbiota, quindi per prevenire e curare alcune malattie. L’approccio probiotico (migliorare la salute umana con l’uso di probiotici) nasce da tempi in cui non si conoscevano con esattezza i microrganismi, ma usando gli “elisir di lunga vita” che in realtà erano dei lassativi, in seguito ai quali sono stati introdotti dei lavaggi intestinali e quindi già si conosceva come la salute fosse legata all’intestino.

Metchnikoff ha creato un testo “The Prolongation of Life” nel 1907, in cui esprimeva come nell’intestino c’è una flora che è estremamente importante nel causare la senilità, ossia riteneva che l’uomo dovesse vivere oltre 100 anni, ma c’è un raccorciamento nella nostra vita dovuto ad un avvelenamento cronico perché nell’intestino umano si era evoluto il colon che ha come scopo l’immagazzinamento degli alimenti, ma questo processo di mantenimento degli alimenti determinava processi di putrefazione degli alimenti stessi che andava a determinare un avvelenamento cronico; nel libro ha fatto anche esempi degli animali in cui esprimeva come gli uccelli terrestri abbiano sviluppato un colon maggiore rispetto a quelli che vivono a contatto con l’acqua e si è ridotta la loro vita. Metchnikoff conclude il ragionamento dicendo che è possibile evitare questa riduzione della vita proponendo l’utilizzo di batteri lattici produttori di acido lattico e ha trovato un alimento che è lo yogurt (che si è diffuso in occidente a seguito a questo libro). Da qui si è iniziato a pensare all’utilizzo di probiotici.

Henry Tissier era un pediatra nel 1900 che studiava la diarrea infantile e ha pubblicato nelle sue pubblicazioni il fatto che i bambini sani presentavano questi batteri con una forma bifida che erano assenti nei bambini malati. Da questo studio ha isolato questo batterio che chiamò Lactobacillus bifidum; oggi è il Bifidobacterium bifidum; ha somministrato questo batterio nei bambini malati e ha visto come effettivamente la malattia veniva curata più facilmente. Ciò che diceva è corretto se si pensa a ciò che succede nel nostro microbiota dal momento della nascita fino alla crescita: nel momento appena successivo alla nascita c’è una fase in cui sono presenti soprattutto bifidobatteri che sono molto importanti per lo sviluppo del sistema immunitario e per la salute di essi.

Gli oligosaccaridi del latte materno sono degli oligosaccaridi che non sono idrolizzati dagli enzimi dell’uomo, ma sono fattori bifidogenici, ossia in particolare aiuta lo sviluppo di bifidobatteri perché essi presentano nel loro genoma molti geni che codificano per l’utilizzo degli oligosaccaridi del latte materno, quindi essi sono selettivi per lo sviluppo del bifidobatterio. Non si conosce con esattezza da dove questo batterio derivi, si può pensare dalla vagina della madre, oppure dal latte materno attraverso la ghiandola mammaria, quindi c’è chi ritiene che il bifidobatterio è presente nell’intestino della madre e poi migra nella ghiandola mammaria attraverso il sistema linfatico.

Il vero padre dei probiotici potrebbe essere anche un uomo bulgaro (Stamen Grigorov) nel 1905 che fu colui che per primo ha isolato il Bacillus bulgaricus e fu il primo a portare verso lo sviluppo a livello mondiale dello yogurt.

Il primo prodotto probiotico creato è stato lo Yakult che è un latticello in cui è presente L. Paracasei, che è in commercio a partire dal 1935. La diffusione nel mondo occidentale di questi prodotti probiotici è partito negli anni 80 con i prodotti Activia e a partire dagli anni 2000 lo sviluppo di questi prodotti è diventato enorme per via dell’interesse sempre maggiore. La parola probiotico non è di origine latina, bensì è un ibrido linguistico con origine latina (pro) e greca (bios) e la definizione è stata data dalla FAO.

Lezione 2

Simbiosi e microrganismi

Simbiosi può avere un'accezione più ampia ossia qualsiasi microrganismo che ha un rapporto con altri microrganismi e quindi tutte le forme di rapporto tra i microrganismi ci rientrano. Nello yogurt ci sono S. Thermophilus e L. Delbrueckii subsp. bulgaricus e vivono in sinergismo o protocooperazione perché hanno un rapporto positivo tra di essi, ma sono in grado di sopravvivere da soli. Il tipo di ceppo e il tipo di latte usato per lo yogurt possono andare a portare differenze nel rapporto tra i due microrganismi.

La parola probiotico compare per la prima volta in una pubblicazione del 1956, ma con un significato differente da quello attuale poiché intendeva una qualsiasi organismo o molecola che andava a portare un miglioramento nella vita di altri organismi. La parola è un ibrido linguistico greco e latino. La definizione di probiotico è nata dall’opinione di numero esperti negli anni 90 in un convegno della FAO.

Probiotici: microrganismi vivi che, se consumati in adeguata quantità, conferiscono beneficio alla salute dell’ospite. Il documento di riferimento ad oggi da un punto di vista filosofico sono ancora le linee guida FAO del 2002. In Italia questa definizione ha una valenza legale a tutti gli effetti perché nel 2005 è stato fornito un documento dal ministero della salute che sono le linee guida probiotici e prebiotici. Con tale documento si esplicita che probiotico non è sinonimo di fermento lattico. Il probiotico viene indicato come microrganismo vivo e vitale che conferisce beneficio alla salute dell’ospite quando consumati in adeguate quantità come parti di un alimento o di un integratore.

Col termine vivo si intende che un microrganismo può riprodursi e fare colonie in un determinato terreno, con vitale si intende che ha un’attività metabolica funzionale. Vengono però posti anche confini precisi nei quali bisogna “stare” quando si parla di un probiotico: in Europa il modo corretto di usare la parola probiotico è solo e soltanto quando siamo nel mondo di alimenti o integratori alimentari. A preoccuparsi della sicurezza e dei claims di alimenti e probiotici è l’EFSA. Nel momento in cui sono usati farmaci con microrganismi vivi per curare una malattia non si parla di probiotici.

Differenze tra definizione FAO e Italiana

I documenti della FAO sono 2 e avevano una finalità comune che definiscono requisiti minimi necessari per definire un probiotico. Il più grosso cambiamento attuale è dovuto al fatto che ora si può ottenere il genoma completo di un certo batterio. In merito alle linee guida si fa riferimento anche a un documento fatto nel 2017 da numerosi esperti (gli stessi convocati dalla FAO). In questa pubblicazione è stato creato il consensus statements, che è un documento in cui sono state date modificazioni:

• Modificazione della definizione ufficiale inglese
• Specificazione che ci fa capire cosa è probiotico realmente o no

Microrganismi negli alimenti

Quindi tutti i microrganismi che si trovano all’interno degli alimenti, se hanno un ruolo positivo sul nostro organismo, sono probiotici? Lee C-H nel 2004 ha scritto in una sua pubblicazione che “molti prodotti alimentari fermentati tradizionali stanno ricevendo crescente attenzione per i loro effetti positivi sulla salute e capacità di prevenire malattie. Si accumulano evidenze scientifiche circa gli effetti fisiologici di questi prodotti”. Nel nostro paese possiamo vedere come i microrganismi lattici si trovano molto spesso in formaggi, ma anche microrganismi che si trovano nelle olive, cetrioli, natto, ecc che sono tutti prodotti fermentati e contengono batteri lattici. Anche il Kefir è un prodotto tradizionale che contiene un mix enorme di microrganismi con moltissimi batteri lattici che sono ritrovabili normalmente nei prodotti probiotici.

Quindi Lee C-H ha supposto che alla luce della definizione della FAO i prodotti fermentati possono essere considerati a tutti gli effetti come prodotti probiotici. Lo yogurt prevede la fermentazione del latte con solo due microrganismi, ossia S. Thermophilus e L. Delbrueckii subsp. bulgaricus, e sono anche stabiliti i valori minimi di 10⁷ UFC/g, e ognuno dei due deve essere presente almeno in quantità di 10⁶ UFC/g.

Critiche alla possibile probioticità dello yogurt

Una prima critica alla possibile probioticità dello yogurt è che si ritiene che i microrganismi dello yogurt non superino la barriera dello stomaco rimanendo vivi; questo è stato però smentito perché in uno studio si sono trovate prove che questi microrganismi rimanessero vivi all’interno dell’organismo nelle feci in molti soggetti, ma anche una riduzione di Enterobacteriocee (E. Coli, Pseudomonas, Shigella, ecc.) e aumento dell’attività B-galattosidasica (positivo perché permette al batterio di usare il lattosio), ma nessun effetto significativo su attività β-glucuronidasica, azoreduttasica e sul profilo in SCFA. Un altro studio ha visto come nello yogurt si è visto lo stesso effetto sulla diarrea nei bambini se paragonato al prodotto probiotico con S. cerevisiae (ceppo Boulardii).

La B-glucuronidasi è un’attività che va contro al processo di glucuronidazione, che consente di rendere meno tossiche delle molecole attraverso un aumento della solubilità della stessa; se c’è questa attività enzimatica viene rotto il legame e la molecola xenobiotica rimane più a lungo all’interno del nostro organismo. L’azoreduttasi è un’attività enzimatica negativa perché può portare alla formazione di ammine aromatiche mutagene e quindi effetto cancerogeno.

Lo yogurt non è probiotico per due motivi

• Motivo microbiologico: quando si parla di proprietà probiotiche bisogna fare riferimento al prodotto con all’interno uno specifico ceppo. Lo yogurt è una categoria di prodotti con all’interno diversi tipi di ceppi selezionati da ogni differente azienda. Non si può generalizzare.
• Motivo legale: i probiotici sono novel food, mentre lo yogurt non rientra nel regolamento dei novel food, bensì ha una sua legge specifica ed è un alimento tradizionale.

Esiste una caratteristica positiva fornita dallo yogurt, ossia una migliorazione della digestione del lattosio perché tutti i batteri di L. Bulgaricus hanno la B-galattosidasi. Se io ho un latte fermentato con effetto probiotico non lo chiamo yogurt perché è un prodotto tipico, bensì “latte fermentato probiotico” che mi dà anche un claim a livello italiano.

Il consumo dei probiotici prima del 1997 non era considerato significativo e non vi erano degli specifici regolamenti e sono quindi inseriti tra i novel food. In un ambito più tecnico-scientifico sono stabiliti dei confini per i probiotici all’interno del consensum statement.