Microbiologia - Terreni Coltura

La coltivazione dei batteri

I terreni di coltura

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La coltivazione dei batteri

I terreni di coltura

La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l'impiego dei cosiddetti "terreni" o "mezzi di coltura", con i quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microrganismo che si desidera coltivare. Il terreno, prima della semina, deve essere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di un sistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto.

Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotte osservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazione del terreno ad opera dei batteri presenti nell'ambiente.

Gli impieghi dei terreni di coltura sono numerosi:

• Conteggio dei microrganismi che contaminano alimenti e superfici;
• Isolamento dei microrganismi;
• Mantenimento in coltura;
• Identificazione e studio delle caratteristiche biochimiche;
• Coltivazione per la produzione di antibiotici, enzimi, tossine, antisieri, vaccini, colture starter;
• Valutazione dell'attività di preparati farmacologicamente attivi (per es.: antibiotici; ricerca sostanze inibenti).

Componenti dei terreni di coltura

I componenti dei terreni di coltura devono soddisfare le esigenze nutritive dei microrganismi che per moltiplicarsi hanno bisogno di fonti di idrogeno, carbonio, azoto, ossigeno, sodio, magnesio, fosforo, zolfo, potassio, manganese, ferro. I componenti dei terreni di coltura sono suddivisibili nelle seguenti classi: peptoni, carboidrati, indicatori, sali minerali, agenti selettivi, agenti solidificanti, ingredienti aggiuntivi¹.

La composizione chimica dei terreni di coltura è differente in relazione alle necessità nutrizionali della specie che si desidera coltivare. Per la maggior parte dei batteri è possibile allestire terreni di coltura sintetici, di composizione definita, nei quali sono presenti, in quantità ben definite, le singole sostanze di cui necessita il germe in esame.

Tuttavia, nella routine diagnostica si ricorre a terreni complessi contenenti sostanze naturali chimicamente non ben definite (peptoni, siero, sangue, estratto di lievito). Questi terreni derivano dai tradizionali "brodi" e hanno il vantaggio di essere economici e di garantire una maggiore rispondenza alle esigenze dei batteri patogeni nel corso del loro isolamento.

¹Vengono anche chiamati "arricchimenti" traducendo dall'inglese la parola "enrichment", tuttavia questo termine potrebbe venire confuso con "terreni di arricchimento" che è invece un terreno estremamente povero di sostanze nutritive.

Peptoni

Le fonti di azoto possono derivare da alimenti quali latte, uova, infusi di carne, patate, pomodori, anche se oramai vi è una enorme disponibilità di prodotti industriali altamente affidabili e che garantiscono un'elevata riproducibilità delle loro caratteristiche fondamentali. Si tratta di idrolizzati di proteine di origine biologica detti peptoni.

I materiali di base per la loro produzione sono la carne, la caseina, la soia, le cellule di lievito, la gelatina. I peptoni sono costituiti da amminoacidi liberi e polimerizzati in catene di lunghezza variabile in rapporto al tipo di idrolisi subita. Comunemente vengono impiegati due tipi di idrolisi: l'idrolisi enzimatica (con enzimi quali la tripsina, la pepsina ed enzimi estratti dalla papaia) e l'idrolisi acida (con acidi inorganici forti quali l'acido cloridrico e l'acido solforico).

Con l'idrolisi enzimatica è possibile agire in punti precisi della proteina e preservare l'integrità degli amminoacidi e delle vitamine presenti nel materiale di partenza; con l'idrolisi acida vengono rotti tutti i legami peptidici e si producono amminoacidi liberi.

Simili ai peptoni sono gli infusi e gli estratti di carne ottenuti per coagulazione delle proteine con il calore.

Carboidrati

Gli zuccheri costituiscono un elemento nutritivo fondamentale. Sono fonte di carbonio e vengono utilizzati anche come substrati fermentabili per la differenziazione dei microrganismi. I più utilizzati sono il glucosio, il lattosio, il mannitolo e il saccarosio.

Indicatori

In microbiologia ve ne sono fondamentalmente tre tipi: indicatori di pH, di ossidoriduzione e di idrogeno solforato.

Tra gli indicatori di pH vanno ricordati il rosso fenolo, il rosso neutro, il blu di bromotimolo e il porpora di bromocresolo (c.d. bromocresol-porpora). Il tornasole e l'indicatore di Andrade sono in disuso, ma in certe formulazioni sono ancora presenti. Gli indicatori di pH hanno lo scopo di evidenziare la formazione di acidi a partire dai carboidrati e la formazione di basi (ioni ammonio) a partire da peptoni, singoli amminoacidi o ammine.

Tra questi, il rosso fenolo è il più sensibile in quanto reagisce anche a minime variazioni di pH nel terreno. Il rosso neutro trova impiego nei terreni per l'evidenziazione degli enterobatteri (per es.: terreno di Mac Conkey).

Gli indicatori di ossidoriduzione più utilizzati sono il blu di metilene (da incolore a blu, se ossidato) e la resazzurrina (da incolore a rosa, se ossidata).

Gli indicatori di H₂S sono costituiti da sali di ferro (citrato ferrico, solfato ferroso, ferro ammonio solfato, ferro ammonio citrato). L'idrogeno solforato, prodotto dai batteri a partire da sodio tiosolfato, reagisce con i sali di ferro dando luogo a ferro solfuro nero. Questa reazione è sfruttata sia nei terreni di coltura solidi (caratteristiche colonie con parte centrale nera), che in quelli liquidi ponendo cartine imbevute di acetato di piombo all'estremità delle provette (l'acetato di piombo viene trasformato dall'idrogeno solforato in solfuro di piombo, nero).

Sali

Hanno tre funzioni fondamentali: fornire i metalli necessari alla crescita microbica (Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, Cu), fornire un'azione tampone al terreno (KH₂PO₄ e K₂HPO₄) e mantenere una adeguata osmolarità al mezzo di coltura (con il NaCl).

Agenti selettivi

Gli agenti selettivi consentono l'isolamento di una specie batterica inibendo le altre. I primi agenti selettivi utilizzati in microbiologia sono stati i coloranti, che ancora oggi vengono inseriti in molte preparazioni. I più noti sono il cristalvioletto e il verde brillante, impiegati in alcuni terreni per enterobatteri.

Tra le sostanze di origine biologica vanno ricordati i sali biliari che trovano impiego nei terreni per l'isolamento dei patogeni intestinali, avendo la capacità di inibire la crescita dei Gram negativi. Altri agenti selettivi sono gli antibiotici, che permettono di selezionare in maniera mirata le specie microbiche da isolare.

Infine, i sali organici e inorganici: tra gli altri vanno citati il cloruro di sodio (che ad alte concentrazioni inibisce sia la flora Gram negativa che quella Gram positiva, eccezion fatta per gli stafilococchi), la sodio azide (che consente l'isolamento selettivo di streptococchi e di enterococchi), il sodio selenito, il sodio citrato, il sodio tellurito e il trifenil tetrazolio cloruro.

Agenti solidificanti

L'agar-agar è l'ingrediente fondamentale per la preparazione della quasi totalità dei terreni solidi. Fu introdotto alla fine del 1800 da un medico tedesco (Walther Hesse) e il suo utilizzo venne poi perfezionato da Robert Koch.

Gelidum è una sostanza estratta dalle alghe rosse del genere, frequenti nei mari tropicali, e ha una struttura polisaccaridica contenente agarosio (70%) e agaropectina (30%). L'agar disciolto a caldo (temperature superiori a 80°C) in un liquido, nella proporzione dell'1-2%, ne provoca la gelificazione durante il raffreddamento.

Agar solubilizzato gel → Liquido + agar → 80°C-45°C <45°C

L'agar solubilizzato ha la caratteristica di fondere a 100°C e, raffreddandosi, di solidificare (quando la temperatura è inferiore a 45°C). Allo stato solido forma una massa gelatinosa polimerizzata che non viene utilizzata dai batteri a scopo nutritivo. L'agar non è tossico per i batteri e solo pochissimi possiedono enzimi (esoenzimi) in grado di attaccarlo (depolimerizzarlo), liquefacendo il terreno.

La superficie di un terreno gelificato con l'1-2% di agar è sufficientemente solida da consentire di operarvi agevolmente, e con umidità tale da consentire la crescita dei batteri ma da non permetterne il movimento (nel caso di batteri provvisti di flagelli, anche se certi germi, quali Proteus spp., riescono a migrare anche in agar all'1-2%). Vi sono alcuni terreni per la valutazione della mobilità che contengono minori concentrazioni di agar (0,2-0,5%).

Il reticolo tridimensionale del gel lascia passare le macromolecole ma, in genere, non permette che batteri seminati in superficie riescano ad approfondarsi tra le maglie. La caratteristica dell'agar di rimanere liquido (o meglio "la caratteristica del liquido in cui l'agar è disciolto di non trasformarsi in gel") fino a temperature di 45°C e quella dei batteri di sopportare brevi esposizioni a queste temperature (45-50°C) è alla base di un metodo di semina cosiddetto "agar batteri" (detto anche "semina per inclusione" o "per incorporazione" o "per dispersione").

Si tratta di disperdere i batteri nel terreno ancora liquido. In conseguenza della gelificazione che accompagna il raffreddamento, i singoli batteri restano inglobati nelle maglie del gel dove possono moltiplicarsi senza possibilità di diffusione. Questo tipo di coltura è utilizzato per l'enumerazione dei batteri presenti negli alimenti.

Ingredienti aggiuntivi

Per migliorare le caratteristiche di fertilità dei terreni di coltura e per la coltivazione di microrganismi esigenti si aggiungono, dopo sterilizzazione in autoclave e raffreddamento a 45-50°C, diversi ingredienti. Il sangue e il siero sono quelli più comunemente impiegati, ma in rapporto al tipo di ricerca da eseguire si ricorre anche all'emoglobina, all'albumina, al rosso d'uovo e a uova intere.

Classificazione dei terreni di coltura

In rapporto allo stato fisico

I terreni di coltura si distinguono in liquidi e solidi, differenziandosi esclusivamente per lo stato fisico.

Terreni liquidi

Il più diffuso era il brodo di carne. Si tratta di un terreno utile per la pratica corrente in quanto consente lo sviluppo di quasi tutti i batteri, la sua composizione esatta non è nota, né ripetibile (oggi è sostituito dai vari brodi nutritivi a formulazione nota). Anche il latte e l'acqua peptonata sono utili in certe occasioni (diluizioni, prearricchimento, crescita di batteri lattici).

Terreni solidi

I più antichi sono il siero di sangue coagulato e la patata (patata glicerinata per i micobatteri). Oggi si ricorre all'aggiunta dell'agar. I terreni solidi sono indispensabili per l'isolamento di colture batteriche pure.

In rapporto alla costituzione chimica

Terreni minimi: servono alla coltivazione di stipiti auxotrofi per determinate sostanze. Si tratta di terreni in cui il fattore limitante la crescita batterica è aggiunto in quantità minime. (Es. Minimal Glucose Medium per gli stipiti auxotrofi per l'istidina del "Test di Ames").

Terreni comuni o normali: servono alla coltivazione di batteri senza particolari esigenze nutritive (Es. "brodo normale", o "brodo semplice"; "brodo normale solidificato con agar" o "agar semplice"). Di uso comune sono il "brodo nutritivo" e l'"agar nutritivo". Contengono peptoni, (0,5%); estratto di carne, NaCl e tampone fosfato (pH ~ 7,0).

Terreni sintetici: la costituzione è nota in quanto i singoli costituenti (organici e inorganici) sono stati aggiunti nelle quantità volute. Si utilizzano quando si conoscono tutti i fattori di crescita del germe in esame. Si possono quindi allestire dei terreni che contengono soltanto le sostanze di cui il germe necessita