Microbiologia Clinica - Biologia Molecolare

La biologia molecolare: cenni storici

Enuncia le “leggi dell’ereditarietà”.

Nel 1866 Gregorio Mendel.

Nel 1909 William Johannsen introdusse la distinzione fondamentale tra genotipo e fenotipo.

• Nel 1944 Oswald Avery effettua il primo esperimento di trasformazione batterica, dimostrando in modo convincente che i geni sono formati da DNA.

Nel 1953 Jim Watson e Francis Crick descrivono la struttura della molecola del DNA.

Le caratteristiche morfologiche e funzionali delle cellule sono determinate dalle proteine (strutturali, di membrana, enzimatiche…).

La biologia molecolare è studio dei fenomeni biologici in termini di strutture e interazioni tra gli acidi nucleici e le proteine.

E l’RNA il concetto che il DNA sono macromolecole informazionali è alla base della biologia molecolare.

Il DNA contiene tutte le informazioni necessarie a specificare le sequenze primarie di tutte le proteine di un organismo.

DNA mantiene le informazioni necessarie per la conservazione degli organismi e per il trasferimento delle informazioni alle generazioni successive.

Nessuna cellula è in grado di produrre una proteina per la quale non ci sia un’informazione precodificata nel DNA.

RNA trasporta le informazioni al citoplasma di una cellula e dirige la sintesi delle proteine necessarie per le funzioni dell’organismo.

Lo stato di salute di una cellula dipende dalla stabilità del DNA e da una adeguata replicazione e traduzione in proteine.

La moderna biologia cellulare cerca di determinare i meccanismi di base della struttura e della funzionalità cellulare.

Gli studi sono sempre più incentrati a livello del gene.

Nucleo Citoplasma

Proteina Fenotipo

DNA RNA Regolazione

Regolazione Regolazione post-traduzionale trascrizionale post-trascrizionale Modulazione

Stabilità Trasporto Traduzione funzionale

Maturazione Modificazione

Biochimica e biologia degli acidi nucleici

Composizione e struttura molecolare

Struttura primaria degli acidi nucleici

Struttura secondaria degli acidi nucleici

È nata negli anni ’70 e si basa sulla biologia molecolare, disponibilità di enzimi capaci di tagliare, unire e replicare il DNA in maniera specifica e trascrivere l’RNA in DNA.

Obiettivo

Fornire la struttura concettuale per le applicazioni diagnostiche della analisi degli acidi nucleici.

Enzimi usati in biologia molecolare

• Endonucleasi di restrizione

Enzimi di restrizione

• Estremità piatte (Blunt end)
• Estremità appiccicose (Sticky end)
• DNA ligasi
• DNA polimerasi
• Frammento Klenow
• Taq polimerasi (PCR)
• Polinucleotide fosforilasi
• Polinucleotide fosfatasi

Le malattie ereditarie

Il materiale biologico per la biologia molecolare: il DNA

• Ogni cellula nucleata racchiude del DNA.
• Solitamente per lo studio di routine in medicina si parte dal sangue totale.
• Le tecniche di estrazione del DNA sono relativamente semplici e riassumibili come segue.

Estrazione di DNA

1. Lisi delle cellule mediante detergenti (SDS).
2. Liberazione del DNA dalle proteine legate mediante un enzima (Proteinasi K).
3. Il DNA viene liberato in soluzione ed estratto con diverse sostanze tipo il cloroformio.
4. Precipitazione con Alcol Etilico.
5. Il DNA precipita forma di filamenti sottovisibili ad occhio nudo.
6. Infine viene disciolto in acqua distillata spin column-based purification method.

L’analisi del DNA

• Identificare nuovi geni.
• Evidenziare particolari frammenti di interesse.
• Determinare la sequenza di un determinato gene.
• Verificare la presenza di mutazioni o alterazioni della sequenza.

Analisi degli acidi nucleici

• Separazione in elettroforesi
• Dosaggi in ibridazione
• Tecniche di amplificazione
• Polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione

Strumenti per l’analisi del DNA

Gli enzimi di restrizione

Sono enzimi di origine batterica in grado di tagliare il DNA a doppia elica in punti specifici, dove riconoscono una precisa sequenza di basi.

Riconoscono generalmente tratti di DNA di lunghezza compresa tra 4 e 6 bp (paia di basi).

Le sequenze riconosciute sono caratterizzate da una simmetria (palindromi), per cui la sequenza 5’ → 3’ di un filamento è identica a quella del complementare.

Alcuni enzimi tagliano lungo l’asse di simmetria generando blunt cioè estremità pari, mentre altri tagliano lasciando estremità 5’ o 3’ sporgenti (sticky ends).

Solitamente un enzima riconosce una sola sequenza e dal taglio si ottengono frammenti di diversa lunghezza.

Una volta tagliati, i frammenti vanno separati solitamente mediante gel elettroforesi.

Enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione

Enzima: Sma I

3’ 5’ G G T C G A A C C C G G G C C A A T T G

C C A G C T T G G G C C C G G T T A A C 3’ 5’

Blunt ends

5’ 3’ G G G C C A A T T G

G G T C G A A C C C C C C G G T T A A C

C C A G C T T G G G 5’ 3’

Enzima: EcoR I

3’ 5’ T C C A T T C G T G A A T T C T T G C G T

A G G T A A G C A C T T A A G A A C G C A 3’ 5’

Sticky ends

3’ 5’ A A T T C T T G C G T

T C C A T T C G T G G A A C G C A

A G G T A A G C A C T T A A 5’ 3’

Analisi di un gene con tecnica del blotting

Gel elettroforesi

L’elettroforesi è una tecnica di separazione che sfrutta la proprietà delle molecole cariche (DNA, RNA, Proteine) di migrare quando sono sottoposte ad un campo elettrico.

La separazione avviene su un supporto inerte all’interno gelificato (agarosio, poliacrillamide) del quale si separano i diversi frammenti.

I gel per elettroforesi sono immersi in una soluzione (tampone di corsa) salina che permette il passaggio di corrente.

Le molecole si separano in base al loro peso molecolare e alla loro carica.

L’RNA il DNA e migrano verso il polo Positivo grazie alle carica negativa conferitegli dai gruppi fosfato.

Gel elettroforesi

Gel elettroforesi

Gli acidi nucleici vengono generalmente separati su gel di agarosio.

Nell’agarosio viene disciolto ETIDIO BROMURO, una dell’sostanza che si intercala tra i filamenti acido nucleico ed emette una luce rosa-arancione fluorescente se esposta raggi UV.

Il gel si pone sotto una lampada a raggi UV e lo si osserva.

Si osservano diverse bande separate lungo la corsia, dall’origine di deposizione fino al margine opposto.

Ogni banda rappresenta un insieme di frammenti di DNA della stessa lunghezza.

Analisi del DNA genomico

Rivelazione con Bromuro di Etidio

Il trasferimento su filtro: il “Southern blotting”

Lo svantaggio dei gel di elettroforesi è la loro fragilità.

Tecnica del blotting

I frammenti di DNA vengono generati solitamente con enzimi di restrizione.

“Southern Blotting”

Il rappresenta uno strumento analitico ampiamente utilizzato in biologia molecolare.

Tecnica ideata da Ed Southern, da cui prende il nome.

Consiste nel trasferimento di singoli frammenti di DNA da gel a filtri di Nylon o Nitrocellulosa.

I filtri sono supporti più resistenti e maneggevoli nelle operazioni successive alla corsa elettroforetica.

Uso di sonde molecolari

Southern Blotting

Il principio del Southern blotting

Il trasferimento del DNA dal gel al filtro avviene per capillarità.

Una soluzione salina, salendo attraverso il gel perché richiamata da carta assorbente, trascina con se il DNA facendolo legare elettrostaticamente alla membrana.

Il DNA prima di essere trasferito viene denaturato con una soluzione di) idrossido di sodio (NaOH 1 Kg Peso Lastra di vetro Carta da filtro 3 fogli di carta 3MM Filtro Vassoio con soluzione di trasferimento Gel Carta 3MM imbevuta Supporto.

Analisi del DNA genomico

Rivelazione con Bromuro di Etidio o con Sonda di DNA

Tratto da Thompson & Thompson Genetica Bromuro di Etidio Sonda di DNA in Medicina - Idelson-Gnocchi

Ma come identifichiamo il frammento di nostro interesse?

Il Concetto di Sonde e di Ibridazione

Le sonde (o probe) e l’ibridazione molecolare

All’interno di una miscela per identificare un frammento specifico, di frammenti di DNA o anche su una membrana dobbiamo metterlo in evidenza.

Possiamo definire SONDA una specie chimica in grado di riconoscere e segnalare, con assoluta specificità e sensibilità, mediante un’interazione molecolare, un’altra specie chimica.

Nel caso del Southern, il bersaglio molecolare della sonda è la sequenza a