Microbiologia 2

Genetica batterica

La variabilità genetica nei batteri viene generata attraverso due processi distinti:

• La mutazione
• La ricombinazione genetica

La capacità di adattamento dei batteri dipende dall’elevato livello di variabilità genetica che essi sono in grado di produrre.

Il genoma batterico consta di due componenti:

• Cromosoma
• Elementi extracromosomici “mobili” (contengono 3 geni non essenziali ma accessori: determinanti di virulenza, geni responsabili del trasferimento genetico orizzontale o verticale):

1. Plasmidi
2. Elementi trasponibili

• Sequenze di inserzione
• Trasposoni
• Elementi invertibili

Cromosoma batterico

• Singolo
• DNA bicatenario e circolare
• Privo di istoni
• Mosaico in natura: contiene geni di diversa provenienza, a seguito di fenomeni di trasferimento genetico orizzontale
• Dimensioni variabili, proporzionali al livello di interazione del microrganismo con l’ambiente

1. Intracellulari obbligati
2. Ambientali

• Per poter essere contenuto nella cellula batterica, il cromosoma è superavvolto.
• Replicazione bidirezionale, da una singola origine. Richiede despiralizzazione.

Plasmidi

• Elementi genetici extracromosomici di piccole dimensioni
• DNA bicatenario e circolare
• Possono trovarsi liberi nel citoplasma oppure “integrati” nel cromosoma batterico
• Non confinati nel singolo ospite: possono essere trasferiti e replicati in diversi ospiti +/- correlati
• Numerosità e tipologia di plasmidi in funzione della specie batterica:

1. Gruppi di compatibilità: dimensioni

• Qualità dell’informazione genetica

1. Scarsa omologia con il cromosoma e raramente indispensabili per la sopravvivenza/moltiplicazione batterica in condizioni “ottimali”
2. Codificano per fattori di virulenza batterica

• Produzione di Pili, tossine, adenosine, siderofori, batteriocine
• Fattori R: determinanti dell’antibiotico resistenza
• Plasmidi F: integrati nel cromosoma

3. Un batterio può perdere un plasmide, in assenza di una pressione selettiva (ad esempio batterio con plasmidi antibiotico-R cresciuto per varie generazioni in assenza di antibiotico)

Elementi trasponibili

Tipologia:

• Sequenze di inserzione - piccole dimensioni, integrazione sito-specifica mediante capoRepublic Sequenze invertite e ripetute, “core” codificante solo per trasposizione
• Trasposoni - rilevanti dimensioni, integrazione sito-specifica mediante IS, “core” contenente uno o più geni. Trasposoni coniugativi. Possibile fusione di diversi trasposoni

Caratteristica traslocazione tra elementi diversi. Generalmente, la traslocazione avviene all’interno della stessa cellula.

Eccezione: trasposoni coniugativi.

2 Meccanismi di trasposizione:

• Conservativa
• Replicativa

La trasposizione posizione induce un effetto “mutageno”.

• Mutazione letale
• Mutazione non letale
• Sequenze di inserzione - piccole dimensioni, integrazione sito-specifica mediante sequenze invertite e ripetute, “core” codificante solo per trasposizione.
• Trasposoni - rilevanti dimensioni, integrazione sito specifica mediante IS, “core” contenente uno o più geni.

I trasposoni

Rappresentano fino al 50% del DNA dell’uomo.

Alle estremità di molti - ma non tutti - i trasposoni, sono presenti le ripetizioni terminali invertite.

Su entrambi i lati portano ripetizioni fiancheggianti dirette: non fanno parte del trasposone e non si spostano con esso ma vengono generate dal processo di trasposizione in corrispondenza del sito di inserzione. Sequenze variabili ma lunghezza costante. Queste ripetizioni indicano che il TE si inserisce dopo aver effettuato dei tagli a scalino.

a. .b. .

I trasposoni nei batteri

I trasposoni batterici contengono soprattutto gli elementi necessari per la trasposizione.

La trasposizione avviene solo con un meccanismo di ricombinazione del trasposone con quello del sito in cui esso traspone, che viene detto di “ricombinazione sito-specifica”. Il trasposone si può inserire soltanto in regioni di DNA in cui si trovano brevi sequenze nucleotidiche che fanno da bersaglio per l’inserzione. La sequenza nucleotidica di tali siti sembra irrilevante e non omologa ad alcuna specifica sequenza del trasposone.

Non occorre quindi affinità tra sequenze del trasposone e sito di inserzione come invece nella ricombinazione omologa, che avviene tra geni aventi le stesse sequenze nucleotidiche.

I trasposoni batterici appartengono a due classi:

• Classe I: i più semplici perché sono costituiti da trasposasi e da due sequenze simili tra loro disposte in senso inverso alle due estremità. Lungo generalmente 900. Ha una trasposizione replicativa. Possiede in pratica solo ripetizioni fiancheggianti, le ripetizioni terminali invertite e il gene per la trasposasi, ma può anche contenere geni importanti.
• Classe II: trasposoni composti sono costituiti da due IS nella stessa direzione o in direzione opposta, che si trovano vicine o trasformano come una sola unità, trasportando con sé la parte di DNA compresa fra loro. Fra le due IS si trovano in genere per la trasposasi e frequentemente almeno un gene per la resistenza un antibiotico punto. Il Tn3, che è il più studiato tra i trasposoni di classe seconda codifica anche per una proteina regolatrice, la quale mediante repressione, contro la sintesi della trasposasi, evitando in tal modo una produzione eccessiva, che non sarebbe utile per un evento quale la trasposizione che avviene con bassa frequenza.

Elementi invertibili: oltre a geni codificanti per la trasposizione, presenza di DNA invertasi capace di invertire l’elemento di 180° nella sua locazione cromosomica.

Isole genomiche: integrate nel cromosoma mediante fago, veicolano geni per la patogenicità dei batteri di una stessa specie differenziandoli da batteri non patogeni.

Meccanismi di variabilità genetica

La variabilità genetica consente al batterio una maggiore fitness, ossia la capacità di adattarsi a diversi ambienti.

I cambiamenti a carico del genoma avvengono mediante:

• Mutazione = modificazione, più o meno estesa, della sequenza nucleotidica, con possibili effetti sulle caratteristiche macroscopiche.

1. Considerato il tempo di generazione medio di una cellula, l’effetto di una mutazione sul fenotipo si esprime in tempi brevissimi
2. Ceppo mutante vs ceppo selvaggio
3. Una mutazione viene selezionata se conferisce un vantaggio selettivo
4. Possono essere talvolta letali per la cellula
5. Mutazioni spontanee insorte durante la duplicazione-riparazione del DNA, a seguito di integrazione-perdita di elementi mobili, per azione e fagica
6. Mutazioni indotte da agenti mutageni chimici, fisici o biologici
7. Reversione della mutazione: può venire nel sito mutato originario o in un sito differente. Annulla la mutazione ristabilendo il fenotipo originario (ceppo revertante)

Mutazioni microlesioni: effetti sul fenotipo

Puntiformi, interessano 1 sola base.

• Inserzione-aggiunta di una base
• Delezione: perdita di una base
• Sostituzione

• Transizione: sostituzione tra basi puriniche e pirimidiniche
• Transversione: sostituzione base pur-pirim con base pirim-pur

Effetti sul fenotipo:

• Sequenza invariata per degenerazione del codice genetico - proteina funzionale (mutazioni silenti)
• Sequenza aa mutata - proteina incompleta, probabilmente non funzionale (mutazioni missense)
• Produzione di un codone di STOP: arresto sintesi proteina, non funzionale (mutazioni nonsense)
• Trasferimento genico orizzontale = coniugazione, trasformazione, trasduzione
• Ricombinazione genetica = conversione lisogenica, fusione del protoplasto

Mutazioni

Una mutazione è un cambiamento ereditario nella sequenza delle basi dell’acido nucleico nel genoma di un organismo punto un ceppo che porta a tale cambiamento è detto mutante.

La mutazione non sempre conduce alla comparsa di un nuovo fenotipo.

Auxotrofo è un mutante con necessità nutrizionali per crescere mentre il progenitore da cui deriva è chiamato prototrofo.

Lo scambio di DNA tra le cellule consente lo scambio di geni e di caratteri fenotipici, dando origine a nuovi ceppi batterici.

Lo scambio di materiale genetico tra organismi e/o cellule diverse si realizza attraverso la ricombinazione genetica.

Questo meccanismo genera elevata variabilità genetica non solo all’interno di popolazioni cellulari della stessa specie ma anche di specie differenti e lontane di un punto di vista evolutivo in un processo che viene definito: “lateral gene transfer”.

Meccanismi di trasferimento genetico orizzontale

I meccanismi di trasferimento genetico consentono la mobilizzazione di sequenze di DNA (plasmidi, parte del cromosoma, trasposoni coniugativi) tra cellule differenti, appartenenti alla stessa specie o a specie differenti:

• Trasformazione
• Coniugazione
• Trasduzione

La sequenza di DNA trasferita potrà integrarsi nel cromosoma della cellula accettrice a seguito di ricombinazione genetica.

• Meccanismo di trasferimento genetico “evoluto” da una primitiva esigenza nutrizionale
• Assunzione di frammenti di DNA solubile dall’ambiente circostante da parte di due cellule batteriche “competenti”
• Osservato sia nei Gram+ che nei Gram -
• Influenzato da:

1. Dimensioni DNA
2. Sensibilità DNA a nucleasi
3. “Competenza” della cellula accettrice

Trasformazione

Trasformazione: la scoperta di Griffith del principio trasformante impiegando Streptococcus pneumoniae.

• La cellula accettrice deve per poter essere trasformata, trovarsi in una particolare condizione che prende il nome di competenza.
• Competenza: capacità cellulare di “catturare” il DNA.
• Il raggiungimento di un livello soglia nella densità cellulare attiva la sintesi ed il rilascio di un fattore di competenza che, agendo a livello della membrana, induce:

• Modificazioni di parete cellulare autolisina
• Sintesi-attivazione di proteine

La competenza può essere:

• Naturale
• Indotta artificialmente, mediante trattamento a freddo con CaCl oppure elettroporazione

La cellula donatrice è una cellula morta.

1. Morte e degradazione del batterio donatore
2. Un frammento di DNA bicatenario interagisce con specifiche proteine alla superficie della cellula “competente”. Il DNA è reso monocatenario da una nucleasi
3. La proteina Rec A promuove la ricombinazione omologa tra il DNA ss donatore e quello ss recipiente.
4. Il trasferimento è completato.

La trasformazione si realizza solo se la cellula ricevente si trova in uno stato di competenza ed esprime sulla superficie:

• DNA binding protein
• Una autolisina della parete cellulare
• Nucleasi

La competenza è regolata dal quorum sensing.

1. Fase: le DNA binding protein legano il DNA trasformante
2. Fase: si ha il passaggio di un filamento all’interno della cellula mentre quello complementare viene degradata dalla nucleasi
3. Fase: il filamento singolo viene legato da proteine specifiche nella cellula e avviene la ricombinazione con regioni omologhe nel cromosoma batterico, mediata dalla proteina Rec A
4. Fase: cellula trasformata

Significato clinico:

• Meccanismo di trasferimento di geni per l’antibiotico-resistenza
• Trasferimento di geni codificanti per fattori di virulenza

Significato biotecnologico:

• Clonaggio di geni “utili”

Significato evoluzionistico:

• Meccanismo di evoluzione/adattamento batterico

Coniugazione

Coniugazione = trasferimento genico unidirezionale mediato da plasmide che richiede un contatto fisico tra le due cellule batteriche.

Avviene sia nei Gram+ che Gram- ma con meccanismi differenti:

• Pilo sessuale (Gram-): è codificato dal plasmide F, è una struttura superficiale prodotta da cellule F+ che riconoscendo un recettore sulla cellula F-, consente la formazione di una “coppia coniugativa” tra le cellule F+ e F-, e in tal modo, il trasferimento del plasmide
• Feromone (Gram+)

Plasmidi coniugativi: plasmidi che possono essere trasferiti tra le cellule mediante coniugazione.

Plasmide F - plasmide della fertilità.

• Geni rep - codificato per la replicazione
• Geni tra - codificano per il trasferimento
• Geni mob - codificano per la mobilizzazione
• 4 quattro elementi IS - mediano l’integrazione nell’endogenote
• Pilo sessuale Pilo F: codificato dal plasmide F, è una struttura superficiale è prodotta dalle cellule F+ che riconosce un recettore sulla cellula F-, consente la formazione di una coppia coniugativa tra le cellule F+ r F- e, in tal modo, il trasferimento del plasmide.

Sulla base della presenza o meno del pilo, si riconoscono 3 tipi cellulari:

• Cellula F+: cellula contenente un plasmide F
• Cellula F-: non contenente un plasmide F
• Cellula Hfr: cellula contenente un plasmide F integrato nel cromosoma

Nella coniugazione Hfr e F-: viene trasferito un segmento di DNA cromosomico. Questo potrà andare incontro a:

• Degradazione nessun effetto
• Circolarizzazione plasmide coniugativo
• Integrazione nuovi caratteri

La cellula accettrice rimane F-.

Coniugazione nei Gram+

• Enterococcus faecalis
• Produzione e rilascio di feromoni da parte della cellula accettrice
• I feromoni inducono la produzione di una sostanza aggregante alla superficie della cellula “donatrice”
• Formazione di aggregati cellulari con trasferimento del plasmide coniugativo

Significato clinico:

• Principale meccanismo di trasferimento di geni per l’antibiotico-resistenza
• Trasferimento di geni codificanti per fattori di virulenza

Significato ambientale:

• Trasferimento della resistenza ad erbicidi, idrocarburi aromatici, metalli pesanti
• Trasferimento di geni per la fissazione dell’azoto tra Rhizobia

Significato tecnico:

• Coniugazione con batteri Hfr in vitro può essere interrotta in tempi diversi con trasferimento di un progressivo di geni

Significato evoluzionistico:

• Principale meccanismo evolutivo-adattativo batterico

Trasduzione

Consiste nel trasferimento di frammenti di DNA cromosomale tra due cellule batteriche mediante un batteriofago (virus batterico).

Esistono due tipi di trasduzione:

• Generalizzata, qualsiasi gene
• Specializzata: trasferimento esclusivo di uno specifico gene batterico

La traduzione consiste nel trasferimento di frammenti di DNA cromosomiale tra due cellule batteriche mediante un batteriofago.

Il fago è un virus in grado di infettare selettivamente le cellule batteriche.

Ha generalmente forma di spillo in cui si conoscono più parti: la testa, contenente l’acido nucleico; essa sormonta un collare, qui attaccata una coda, la quale si sfrangia all’estremità di 5-6 fibre affatto libere.

Il riconoscimento dell’ospite da parte del fago avviene attraverso un legame che si stabilisce tra le proteine del capside e specifici recettori siti sulla parete del batterio.

Nella coda del fago è presente un complesso molecolare in grado di iniettare l’acido nucleico del fago attraverso la parete del batterio ospite punto una volta che l’acido nucleico è penetrato nella cellula, seconda del tipo di fango si potrà osservare:

• Un ciclo litico: il virus si riproduce immediatamente, uccidendo la cellula ospite che va incontro la lisi, liberando la progenie fagica. Un virus che si riproduce esclusivamente attraverso il ciclo litico viene definito un virulento
• Un ciclo lisogeno: il virus integra il proprio acido nucleico nel genoma della cellula ospite. I batteri che ospitano particelle virali non litigare sono detti lisogeni ed i virus vengono definiti temperati. Il profago può rimanere silente per molto tempo, fino a quando verrà attivato e, abbandonando il cromosoma batterico, innescherà un ciclo litico.

La capacità di passare dal ciclo lisogeno a quello litico e di grande vantaggio evolutivo per il fago.

Quando la cellula ospite in fase di rapida crescita e riproduzione, il profago rimane nello stato lisogeno. Quando, invece, la cellula ospite viene danneggiata, il profago interrompe lo stato quiescente integrato ed attivarci più litigo per disseminare la propria progenie.

A seconda del tipo fagico coinvolto, il meccanismo di trasduzione può avvenire secondo due differenti modalità:

• Trasduzione generalizzata: in cui qualsiasi gene può essere trasferito
• Trasduzione specializzata: in cui solo specifici geni possono essere trasferiti

1. Adsorbimento del fago litico alla superficie del batterio sensibile.
2. Penetrazione del genoma fagico nel batterio. Utilizzo dei sistemi metabolici cellulari per la sintesi e l’assemblaggio delle componenti virali.
3. In alcuni casi, frammento di DNA batterico o un plasmide possono essere erroneamente inseriti in alcuni il capsidi virali.
4. Rilascio dei fagi batterici a seguo di lisi batterica
5. Il fago trasduttore assorbe ad un batterio sensibile
6. Penetrazione del DNA fagico
7. Il fago traducente non è in grado di innescare un ciclo litico ma può permettere al DNA fagico di combinare con il DNA della cellula accettrice

Nella trasduzione generalizzata, selezione dei geni tradotti è randomizzata. Ogni gene ha la stessa probabilità di essere tradotto.

Trasduzione specializzata: è un trasferimento esclusivo di uno specifico gene batterico. Durante l’excisione del profago possono verificarsi degli errori e genoma fagico si excide insieme ad un tratto del DNA batterico adiacente, fenomeno raro. Si può trasferire solo un frammento cromosomico contiguo al sito di integrazione. Se non si sono prese informazioni fagiche essenziali, il DNA fagico può replicarsi ed originare una progenie composta da particelle fagiche difettive.

• Un fago temperato assorbe al batterio sensibile e vi inietta il suo genoma
• Il genoma fagico ricombina con il nucleoide batterico diven