Microbiologia

Introduzione

Gli organismi microscopici sono definiti sulla base delle loro dimensioni le quali sono nell’ordine dei-6 micrometri (µm), ovvero 1 x 10 metri. Ci si riferisce prevalentemente a organismi unicellulari.

I microrganismi appartengono a tutti e tre i domini della vita ossia Bacteria, Archea ed Eucarya. I primi due domini sono organismi procarioti ed esclusivamente microrganismi; gli eucarioti sono invece organismi sia uni- sia pluricellulari. In riferimento agli eucarioti unicellulari ci sono prevalentemente funghi e alghe unicellulari.

La microbiologia nasce come disciplina nel 1600 quando lo sviluppo dei primi microscopi conferisce la possibilità di individuare degli organismi piccoli nelle matrici ambientali, ovvero acqua e aria. Oltre ad occuparsi di microrganismi appartenenti ai tre domini della vita, la microbiologia tratta anche di virus, ovvero delle entità biologiche di parassiti intracellulari obbligati non considerati veri e propri esseri viventi. Questi ultimi non vivono in assenza di un ospite, il quale può essere sia un batterio sia un eucariote.

Un importante stadio nell’evoluzione della microbiologia è stato l’isolamento di ceppi microbici in coltura pura. Questo sviluppo, avvenuto grazie agli studi di Koch e Pasteur, ha permesso di far crescere su un terreno solido colonie microbiche e di poter quindi isolare i microrganismi dagli ambienti in cui vivono.

I microrganismi possono anche essere individuati nell’ambiente attraverso l’utilizzo delle tecniche molecolari, ovvero tecniche moderne che permettono di andare a studiare il metabolismo microbico a partire dalle molecole che compongono la cellula; ad esempio dal DNA e dall’RNA si possono trarre delle informazioni circa il metabolismo del microrganismo.

Le tecniche molecolari possono essere utilizzate o in cultura pura, quindi applicate ad un singolo microrganismo isolato, o nelle comunità complesse presenti nell’ambiente. In questo caso il DNA utilizzato è un DNA metagenomico, ovvero costituito da informazioni provenienti da microrganismi differenti.

Nell’immagine è raffigurato un albero filogenetico che rappresenta la diversità biologica ad oggi nota presente nella biosfera. Il dominio bacteria (cerchiato in rosso) è di molto più grande rispetto agli archea e agli eucarya (rispettivamente in verde e in giallo). I procarioti sono quindi la porzione più importante trattata nella microbiologia. I puntini rossi al termine delle ramificazioni rappresentano i raggruppamenti di organismi di cui non si ha alcun rappresentante coltivabile; la comunità scientifica non è ancora riuscita ad isolare in cultura pura tali microrganismi.

La distanza tra due punti (frecce gialle) nell’albero filogenetico è definita distanza evolutiva. Tanto più grande è la diversità evolutiva tra i microrganismi maggiore è la diversità metabolica. È proprio la diversità metabolica che ha permesso ai microrganismi di colonizzare praticamente qualunque tipo di ambiente.

Il successo evolutivo dei microrganismi risiede nella loro capacità riproduttiva; essi sono infatti in grado di riprodursi esponenzialmente nell’arco di poco tempo, dando luogo a moltissime generazioni. Questo permette anche il verificarsi di una rapida evoluzione data dall’accumulo di variazioni genetiche generazione dopo generazione.

Un'altra ragione del loro successo evolutivo è data dal fatto che sono stati tra i primi organismi ad essersi evoluti sulla Terra, quindi il tempo che hanno avuto per accumulare specifiche capacità è infinitamente maggiore di quello avuto dagli eucarioti.

Storia della microbiologia

La microbiologia è una scienza giovane in quanto l’osservazione dei singoli microrganismi risulta impossibile ad occhio nudo. Solo nella seconda metà del 1800 fu possibile iniziare a studiare i microrganismi in laboratorio. Tuttavia, è possibile vedere i loro aggregati (corpo fruttifero dei funghi, biofilm, tappeti microbici, colonie, muffe, ecc.).

L’uomo è stato capace di sfruttare le capacità metaboliche dei microrganismi ancora prima di percepirne l’esistenza (pane, yogurt, birra, formaggi, ecc.).

Il primo importante passo per lo sviluppo della microbiologia come scienza è stato l’avvento del microscopio, ideato nel 1600 da Robert Hooke. Egli si servì di tale strumento per raffigurare i corpi fruttiferi dei funghi, non ancora i singoli microrganismi. Successivamente, Antonj van Leeuwenhoek fu il primo a descrivere i batteri, i lieviti e i protozoi oltre ad individuare alcune cellule, definite da lui animalcules, nell’ambiente acquatico. Dopo queste osservazioni l’esplorazione del mondo microbico si arrestò per circa 100 anni.

Nell’immagine è raffigurato il microscopio di van Leeuwenhoek, caratterizzato da una sola lente nella dove il campione viene posizionato sulla punta dello spillo. La messa a fuoco è consentita grazie al movimento dello spillo tramite una vite che allontana o avvicina il campione spostandolo verticalmente o orizzontalmente. La microbiologia “riprende” poi nel 1800 dove individuiamo diverse personalità importanti, tra le quali spiccano Paul Ehrlich e Hans Christian Gram. Essi sviluppano due metodi di colorazione tuttora utilizzati: il primo sviluppa la colorazione vitale dei batteri con blu di metilene, il secondo sviluppa un metodo di colorazione differenziale che da lui prende il nome di colorazione di Gram. Quest’ultima permette la suddivisione tra organismi Gram-positivi e Gram-negativi.

Teoria della generazione spontanea

In questo periodo nasce la teoria della generazione spontanea secondo la quale dalla sostanza organica inanimata si genera spontaneamente la vita. Ad esempio dal cibo in putrefazione si vedevano nascere diversi organismi tra cui larve, mosche, topi, girini, e così via. Il primo tentativo di confutazione della generazione spontanea è da attribuire a Francesco Redi, i cui esperimenti sono raffigurati a sinistra. Nell’immagine (a) è raffigurato un pezzo di carne posto all’aria aperta; dopo qualche giorno si sviluppano larve di mosche.

Nell’immagine (b) la carne è coperta da un foglio di carta e, in questo caso, lo svilupparsi di larve di mosche non avviene. Questa è già una confutazione della teoria della generazione spontanea, in quanto prova che lo sviluppo degli organismi non dipende dalla sostanza organica ma vengono portati dall’esterno. Nell’immagine (c) la carne è ricoperta da una garza, la quale permette il passaggio dell’aria ma non di mosche o altri corpuscoli di dimensioni maggiori al reticolato. Il risultato è lo stesso dell’esperimento (b), le larve di mosche infatti non si sviluppano. S’intuisce quindi che lo sviluppo di larve di mosche non dipende da elementi presenti nell’aria, ma da qualcosa di grossolano (mosche o uova). La prova di quanto detto risiede nell’immagine (d); se si prende un pezzo di garza utilizzata nell’esperimento (c), lo si pone con un pezzo di carne e si sigilla il contenitore, ecco che avviene lo sviluppo delle larve di mosca grazie a ciò che avevano precedentemente depositato sulla garza stessa.

Questo esperimento confuta la teoria della generazione spontanea per gli organismi macroscopici, ma il dubbio per i microrganismi persiste. La confutazione complessiva della generazione spontanea avviene ad opera di Spallanzani e Pasteur. Spallanzani osservò che un brodo, in assenza di trattamento termico, sviluppa una torbidità sia nel caso in cui il contenitore è aperto, sia nel caso in cui è chiuso. Il risultato cambia se il brodo viene trattato termicamente portandolo a ebollizione a seguito della quale viene posto in parte in un’ampolla aperta ed in parte in un’ampolla chiusa. Nel primo caso si osserva un intorbidimento, nel secondo no (almeno per la maggior parte dei casi in quanto alcuni organismi sono resistenti all’ebollizione).

I sostenitori della teoria della generazione spontanea sostenevano che l’ebollizione distruggeva la forza vitale grazie alla quale si generano i microrganismi. Pasteur utilizza invece una fiasca entro cui viene versato del brodo. Questa fiasca è modificata e presenta un collo la cui ripiegatura permette l’ingresso dell’aria ma non dei pulviscoli i quali si depositano nella ripiegatura stessa. Pasteur porta ad ebollizione il brodo andando così a sterilizzarlo. In questo caso, se il liquido viene lasciato nella fiasca posta verticalmente (b) non si sviluppa torbidità, mentre se la fiasca viene inclinata (c) e il brodo entra quindi in contatto con gli elementi pulviscolari stoccati nella ripiegatura, avviene lo sviluppo di torbidità.

Questi risultati confutano l’obiezione della forza vitale in quanto, se davvero era un elemento presente nell’aria, avrebbe dovuto agire anche nel caso (b), dove comunque la fiasca è aperta all’aria. Dalla confutazione della teoria della generazione spontanea nascono la teoria cellulare, secondo la quale ogni essere vivente è formato da una o più cellule, e la teoria della biogenesi, secondo la quale ogni cellula deriva da un’altra cellula e quindi ogni organismo vivente deriva da un altro organismo vivente.

Sviluppo delle tecniche di base

Robert Koch e collaboratori (tra cui Julius Petri) sviluppano metodi, tuttora utilizzati, per coltivare microrganismi su un terreno solido permettendone l’isolamento in coltura pura.

Tramite l’utilizzo di una struttura detta capsula Petri, viene utilizzato (ad oggi) l’agar come elemento di solidificazione per seminare microrganismi su un terreno solido. Questo metodo porta alla formazione di colonie microbiche, ovvero gruppi clonali di cellule (ovvero tutte uguali) che si sono generate a partire da un unico seme.

Le colonie microbiche sono molto differenti fra di loro in quanto costituite da organismi differenti. Una colonia microbica isolata costituisce una coltura pura, ovvero un insieme di organismi clonali derivati da un unico capostipite ancestrale. La coltura pura è importante perché ci permette di studiare le caratteristiche isolate di ciascun organismo.

L’isolamento in coltura pura è primariamente servito per lo studio delle malattie infettive. Già precedentemente era noto che il trasferimento della malattia potesse avvenire tramite mezzi di trasmissione (come acqua o aria) senza che ci fosse un contatto diretto tra due individui. I microrganismi iniziano ad essere ritenuti i responsabili di tale trasmissione, cosa che viene provata grazie al lavoro di Koch e Pasteur.

• Rober Koch. Isola per la prima volta un microrganismo causa di una malattia, ovvero il Bacillius anthracis che è l’agente eziologico dell’antrace. Successivamente isola anche il batterio Mycobacterium tuberculosis, causa della tubercolosi e il vibrione del colera.

Koch lascia quattro postulati i quali devono essere tutti verificati per stabilire che un microrganismo è l’agente eziologico di una determinata malattia.

• Il sospetto patogeno deve essere presente in tutti i casi di malattia ed essere assente negli individui sani.
• Il sospetto patogeno, una volta individuato nell’individuo malato, deve poter crescere in coltura pura.
• Una volta isolato, il sospetto patogeno deve portare alla malattia animali sani se iniettatogli.
• Dall’animale artificialmente infettato deve essere possibile isolare nuovamente il microrganismo.

I quattro postulati di Koch sono stati poi trasferiti a livello molecolare per individuare quale determinante genetico conferisce la patogenicità al microrganismo analizzato. Infatti, uno stesso microrganismo può essere patogeno oppure no, dipendentemente dall’aspetto genetico.

• Per stabilire se un determinato gene conferisce patogenicità, deve essere presente in tutti i ceppi patogeni e assente in quelli sani.
• Se, tramite tecniche genetiche, viene inattivato il gene sospetto implicato nella patogenicità, si deve avere una riduzione della patogenicità.
• La reversione dell’inattivazione del gene sospetto deve portare ad un ripristino del livello di patogenicità iniziale.

Lotta alle malattie infettive

Lo sviluppo degli antibiotici si deve a Fleming e Domagk. Essi sono rispettivamente gli scopritori della penicillina e dei sulfamidici. Da allora sono state scoperte una ventina di classi di antibiotici.

La scoperta della diversità microbica

Sempre intorno al 1800 nascono i primi interessi della microbiologia in ambito ambientale. Beijerinck e Vinogradskij furono tra i primi microbiologi a studiare i microrganismi dell’ambiente.

Beijerinck sviluppò la tecnica delle colture di arricchimento che consiste nella creazione di condizioni artificiali che permettono la crescita selettiva di alcuni organismi rispetto ad altri. Vinogradskij svolse invece un esperimento noto con il nome di colonna di Vinogradskij, che permise di studiare in maniera approfondita i processi chemiolitotrofi. La chemiolitotrofia è un tipo di capacità metabolica peculiare di alcuni organismi che utilizzano sostanze inorganiche come fonte di energia (quindi come donatori di elettroni nei processi di respirazione).

La colonna di Vinogradskij è una coltura di arricchimento che permette la stratificazione di organismi con capacità microbiche differenti lungo una colonna d’acqua. Nella parte più bassa (nel sedimento), data la presenza di sostanza organica e l’assenza di ossigeno, ci sono microrganismi che producono idrogeno a seguito di processi fermentativi. L’idrogeno risale lungo la colonna e, data l’assenza di ossigeno e la presenza di solfati, nella zona superiore si sviluppano batteri solfatoriduttori i quali riducono i solfati a solfuri. Questi risalgono trovandosi in due condizioni differenti: nella parte più bassa degli strati superiori si ha una zona anossica, poi una porzione di transizione a bassa concentrazione di ossigeno e, nella parte più alta si ha una zona ossica.

La zona anossica è una zona illuminata, quindi la presenza di solfuri e la luce costituiscono i parametri ideali per lo sviluppo di microrganismi anossigenici fototrofi. La loro fototrofia (processo metabolico grazie al quale la luce è utilizzata come fonte di energia) non produce ossigeno (perché anossigenici) ma utilizza solfuri come donatori di elettroni (stesso ruolo dell’acqua nella fototrofia ossigenica). Questi organismi si stratificano rispetto alla concentrazione di solfuri.

Nella zona ossica sono presenti microrganismi zolfo-ossidanti (detti chemiolitotofi) i quali utilizzano il solfuro (che risale con la colonna d’acqua), lo ossidano e ottengono energia. Nella zona superiore, dove la concentrazione di zolfo si azzera, la presenza di ossigeno e di luce è abbondante (oltre che di anidride carbonica) e questo porta alla formazione di fototrofi ossigenici batterici o eucarioti.

Classificazione dei microrganismi

Solo con l’avvento della filogenesi molecolare, Carl Woese e collaboratori definiscono nel 1990 i tre domini della vita: Bacteria, Archea ed Eucarya. La filogenesi molecolare è lo strumento che ci permette di determinare le relazioni evolutive e filogenetiche tra i vari organismi. Carl Woese trovò un marcatore universale per l’applicazione della filogenesi molecolare, ovvero il gene che codifica per le sequenze nucleotidiche dell’rRNA. Il confronto della sequenza nucleotidica di questi geni permette di disegnare l’albero filogenetico.

Evoluzione e biodiversità

La Terra si è formata all’incirca 4,5 miliardi di anni fa, sulla base di analisi d’isotopi radioattivi a lento decadimento nelle rocce. Per circa 200 milioni di anni non è esistito alcun tipo di organismo vivente. Successivamente è avvenuta la formazione di molecole organiche, quali amminoacidi, basi nucleiche e zuccheri, sintetizzate mediante reazioni chimiche spontanee.

Da queste si sono sviluppati i primi organismi autoreplicanti a RNA. Questa ipotesi è supportata dal fatto che l’RNA ha capacità catalitiche osservabili sia nell’rRNA (RNA ribosomiale) sia nel tRNA (RNA di trasporto) e si pensa che il primo RNA avesse anche capacità autoreplicative, quindi era in grado di catalizzare la sua stessa replicazione. Ad oggi, questa capacità autoreplicativa è andata persa in quanto affidata alle proteine. Successivamente, con l’aumento della complessità di queste cellule primordiali, si è evoluto un trasferimento dell’informazione genetica dall’RNA al DNA. Il DNA è quindi quell’acido nucleico adibito al mantenimento dell’informazione genetica mentre l’RNA si occupa della sua trascrizione in proteina.

Giunti a questa cellula primordiale, l’evoluzione è avvenuta tramite un rimescolamento delle capacità genetiche tra le varie cellule, sfociato nella divergenza tra le due linee filogenetiche di batteri e archei. Questi due domini si sono evoluti da quello che viene definito l’ultimo antenato universale comune (LUCA), datato tra i 3,8 e i 3,7 miliardi di anni fa.

Tutti questi processi si pensa siano avvenuti al di sotto della superficie terrestre, vicino alle sorgenti idrotermali sul fondo degli oceani. Questo perché le radiazioni solari che non erano schermate dallo strato di ozono, quindi sul fondo dell’oceano non compromettevano la struttura e la stabilità dei composti organici. Inoltre, questi sistemi sono caratterizzati da flussi di sostanze organiche ridotte che si ipotizza abbiano fornito l’energia necessaria per sostenere la vita primordiale. Si ipotizza infatti che queste prime cellule abbiano avuto disponibilità di energia sotto forma di composti organici ridotti quali idrogeno e idrogeno solforato.

Quali sono i vantaggi e gli svantaggi di avere un’organizzazione a DNA rispetto a RNA? Il mondo a RNA si è sviluppato prima quindi gli organismi hanno necessariamente...