Biochimica - metabolismo dei fosfolipidi

Pro-memoria

Per il metabolismo vedi schemi fotocopiati.

Ricordare

Il surfactante è una di-palmitoil-fosforilcolina ad elevato potere tensioattivo che si forma a livello degli alveoli polmonari per deacilazione di un normale fosfatidil-colina ad opera di una fosfolipasi di tipo 2 e successiva acilazione in presenza di palmitoilCoA. La caratteristica di questa molecola è la presenza di un acido grasso saturo, anziché insaturo, solitamente acido arachidonico, in posizione 2 della lecitina.

In effetti questa lecitina insolita è parte di una lipoproteina tipica che è presente nel liquido extracellulare che riveste gli alveoli ed impedisce, per il suo elevato potere tensioattivo, agli alveoli di interagire fra di loro e quindi il collassamento del polmone durante i processi respiratori.

Metabolismo dei fosfolipidi

• Fosfolipidi contenenti glicerolo: acido fosfatidico (PA), fosfatidilcoline o lecitine (PC), fosfatidiletanoloamine o cefaline (PE), fosfatidilinositoli (PI), fosfatidilserine (PS), plasmalogeni. Sono tutti dei di-acilglicerolderivati, ossia hanno tutti due acidi grassi legati con legame estereo agli ossidrili in posizione 1 e 2 α e β del glicerolo, fatta eccezione per i plasmalogeni che sono degli alchenil-acil gliceroli, in quanto in posizione cioè 1, portano un alcol insaturo legato all’ossidrile del glicerolo con legame etere.

Caratteristica di questi lipidi è la loro distribuzione a livello cellulare in quanto quasi esclusivamente localizzati a livello delle membrane ed in particolare della membrana plasmatica sulla quale PC, unitamente alle sfingomieline ed i glicolipidi, sono sul lato esterno mentre PI, PS e PE sono sul lato citoplasmatico.

Catabolismo dei di-acil glicerolo derivati: PA, PC, PE, PS, PI

Vengono tutti degradati inizialmente da delle fosfolipasi intracellulari definite in rapporto al legame scisso in fosfolipasi A, B, C, D.

Le fosfolipasi A idrolizzano il legame estereo che lega l’acido grasso in posizione 1 o e 1 e danno luogo alla formazione di un lisoderivato 1 (per PC si parla di lisolecitina).

Le fosfolipasi A idrolizzano il legame estereo che lega l’acido grasso in posizione e 2. Formano pertanto un lisoderivato 2.

Le fosfolipasi C idrolizzano il legame estereo che lega il fosfato al di-acilglicerolo e pertanto formano di-acilglicerolo (DAG) ed un fosfoderivato (fosforil-colina, fosforil-etanolamina, fosforil-inositolo, fosforil-serina).

Le fosfolipasi D idrolizzano il legame estereo che lega DAG-fosfato o acido fosfatidico (PA) alla colina, etanolamina, inositolo, serina.

Sul lisoderivato 1 e 2 agiscono a loro volta delle lisofosfolipasi che allontanano il residuo acile formando glicerol-fosfato legato a sua volta con colina, etanolamina, inositolo, serina.

Qualsiasi prodotto del catabolismo che sia stato privato degli acili in 1 e 2 non è più un lipide e quindi verrà degradato da delle idrolasi aspecifiche (esterasi) sino a formare i singoli componenti elementari: glicerolo, fosfato, colina, etanolamina, inositolo e serina.

Queste fosfolipasi si localizzano sulla membrana del reticolo endoplasmico, faccia esterna, sulla membrana esterna e sulla faccia esterna della membrana interna dei mitocondri e sulla membrana plasmatica ove concorrono al rimaneggiamento dei fosfolipidi di membrana.

In particolare le fosfolipasi A1 ed A2 richiedono per la loro attività calcio. Una fosfolipasi A2 particolarmente attiva è presente nel veleno del cobra ed è responsabile dell’azione letale di questo veleno in quanto la sua azione idrolitica a carico di fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina presenti sulla membrana degli eritrociti porta alla formazione dei lisoderivati corrispondenti generando così molecole a potente azione detergente sulla membrana eritrocitaria con conseguente emolisi massiva.

Prodotti del catabolismo e segnali intracellulari

I prodotti del catabolismo di questi fosfolipidi sono frequentemente molecole attive in grado di originare segnali intracellulari o di essere esse stesse fattori di regolazione per definiti enzimi.

Ad esempio, in posizione 2 i glicerofosfolipidi portano di solito un acido grasso poli-insaturo quale:

• L’acido arachidonico, precursore di molecole a potente azione infiammatoria (lipossine, prostaglandine, prostacicline, leucotrieni), o ad azione aggregante e stimolante le piastrine (tromboxani sintetizzati dalle piastrine), proprietà alla base del processo della coagulazione con formazione del coagulo di fibrina.

L’azione anti-infiammatoria degli steroidi in parte è dovuta alla generazione da essi indotta di una proteina inizialmente identificata come lipocortina, ed oggi come annessina 1 (ANX1), inclusa nella famiglia delle annessine che comprende proteine capaci di interagire con un meccanismo calcio dipendente con la membrana plasmatica di diversi tipi di cellule, da cui il nome annessine; caratteristica di queste proteine è la presenza al centro della loro molecola di 4-7 sequenze ripetute formate da circa 70 aminoacidi che ne permettono la identificazione e ne definiscono la capacità di legarsi alla membrana plasmatica in corrispondenza del foglietto fosfolipidico.

L’estremo N-terminale probabilmente è specifico di ogni annessina. ANX1 funge da potente inibitore della fosfolipasi A e quindi blocca la liberazione di acido arachidonico in posizione 2 di fosfolipidi, prevenendo in questo modo la generazione di molecole proinfiammatorie; inoltre l’azione anti-infiammatoria di ANX1 prevede anche l’inibizione della generazione ed attivazione di NO sintasi inducibile (iNOS) a livello dei macrofagi, e della prostaglandina ciclo-ossigenasi isoforma 2 (COX2) a livello della microglia del sistema nervoso centrale, riduce la migrazione cellulare soprattutto dei neutrofili e monociti; di recente ANX1 è stata identificata come capace di scatenare segnali di tipo “eat-me” in cellule apoptotiche, mirati a potenziarne il riconoscimento, la fagocitosi e quindi la digestione da parte di cellule macrofagiche, evento che comporta la conclusione del processo infiammatorio.

L’intervento della fosfolipasi C è alla base delle generazioni di numerosi segnali legati alla formazione di DAG e di fosfo-inositoli, a loro volta molecole di segnale.

Due distinte fosfolipasi C intervengono nella degradazione dei fosfatidil-inositoli di membrana, identificate come fosfolipasi C (PLC)-β (PLC-β) e PLC-γ, entrambe legate alla membrana plasmatica probabilmente per interazioni idrofobiche.

PLC-β è sotto controllo di particolari proteine di membrana, dette proteine Gq, che sono degli eterotrimeri formati da tre subunità delle quali α e γ sono ancorate alla membrana plasmatica a mezzo di catene formate da unità prenoidi (aggregazione di molecole di isoprene) o da catene aciliche (acido miristico o laurico di solito legati a residui di cisteina o di arginina e lisina a mezzo di legami tioesterei ed amidici rispettivamente).

In assenza di stimolo le tre subunità sono legate fra loro, con α legata a guanosindifosfato (α-GDP), ed il trimero è in contatto con una proteina integrale di membrana, che attraversa quest’ultima con 7 ripiegamenti in struttura α-elicoidale, che funge da recettore per ormoni polipeptidici quali vasopressina e bradichinina.

A seguito dell’interazione ligando-recettore, quest’ultimo subisce una modificazione conformazionale che si traduce alla proteina Gq (α-GDP) ed induce la subunità α a scambiare GDP con GTP; di conseguenza la proteina Gq si dissocia: il dimero βγ rimane sulla membrana, mentre α-GTP, staccatasi dal trimero, prende contatto con PLC-β e la attiva.

In contemporanea però, a seguito del distacco dal trimero che intrinsecamente è una idrolasi capace di trasformare GTP in GDP, α-GTP acquisisce questa attività idrolasica, attacca GTP ad essa legato, lo converte in GDP e di conseguenza come α-GDP torna a legarsi con il dimero βγ ricostituendo così il trimero inattivo Gq. Pertanto il meccanismo di attivazione della PLC-β è intermittente.

PLC-γ è invece attivata a seguito dell’interazione di specifici ligandi, tutti di natura polipeptidica ad azione ormonale o fattori di crescita, con recettori di membrana che si comportano come protide tirosina cinasi (PTK).

L’interazione ligando-recettore comporta dapprima l’attivazione del recettore che come PTK attiva fosforila se stesso a livello di residui di tirosina (autofosforilazione del recettore) e successivamente fosforila altre proteine citosoliche o di membrana e tra queste PLC-γ che acquisisce così attività sul fosfo-inositide di membrana substrato liberando così fosfoinositolo di differente grado di fosforilazione.

L’inattivazione del recettore è mediata da protide tirosina fosfatasi associate al recettore. Entrambi PLC-β e PLC-γ sono attivate da calcio. Poiché entrambi sono attive su fosfoinositidi ne consegue che i prodotti della loro azione, DAG ed inositolo-fosfato, possono formarsi a seguito di stimoli differenti.

DAG, fosfoinositidi e PKC

DAG è un potente attivatore di alcune proteina cinasi capaci di fosforilare proteine in serina e treonina identificate come protide cinasi C (PKC).

Fosfatidil-inositoli, definiti anche fosfoinositidi, per meccanismi vari indotti da differenti stimoli non del tutto identificati, possono essere fosforilati ad opera di specifiche cinasi a livello delle posizioni 3, 4, 5 dell’inositolo formando i corrispondenti fosfatidil inositolo monofosfato PIP3, PIP4, PIP5 o bifosfato PIP4,5, PIP3,4, PIP3,5, o trifosfato PIP 3, 4, 5.

L’intervento di PLC-β e PLC-γ comporta allora la formazione di inositolo differentemente fosforilato, monofosfato IP1, bifosfato IP1,3, IP1,4, IP1,5, trifosfato IP1,3,4, IP1,4,5, tetrafosfato IP1,3,4,5.

IP1,4,5, detto correntemente IP3, è potente attivatore del rilascio del calcio dal reticolo endoplasmico in cui si trova accumulato fino a concentrazione intorno a 10^-3 M, mentre nel citoplasma di una cellula non stimolata la concentrazione del calcio è pari a 10^-7 M.

La fosforilazione in 3 dei fosfatidilinositoli è frequentemente garantita da una cinasi specifica, la fosfatilinositolo 3-cinasi (PIP3K), che è stimolata da insulina ed è coinvolta nell’ingresso del glucosio all’interno della cellula muscolare (miocita) ed adiposa (adipocita).

Uno degli enzimi potentemente controllato dal metabolismo degli inositol-fosfatidi è la proteina cinasi C (PKC), in grado, se attiva, di fosforilare proteine a livello di residui di serina e treonina. È definita C perché estremamente sensibile al calcio oltreché a DAG, entrambi prodotti per intervento delle fosfolipasi Cβ e Cγ su fosfoinositidi fosforilati in 4 e 5 sull’inositolo; importante ricordare che su azione delle fosfolipasi DAG rimane inserito sulla membrana quale componente del fosfolipide originario che contribuisce a formare il doppio strato lipidico della membrana, mentre il calcio si libera nel citoplasma.

PKC nella sua forma costitutiva è inattiva e citoplasmatica; è formata da una sola catena polipeptidica di massa molecolare intorno ad 80 kDa, in cui si possono identificare 4 domini, indicati C1, legante DAG, ricco in aminoacidi basici e quindi ricco positivamente, C2, legante calcio, C3 legante ATP, e C4 ricco in aminoacidi acidi e quindi carico negativamente, legante il substrato cioè la proteina da fosforilare quando PKC si comporta come cinasi attiva.

In forma inattiva PKC è ripiegata su sé stessa in modo tale per cui C4 è a contatto con C1 a mezzo di interazioni ioniche e quindi è preclusa la capacità di interagire con la proteina substrato.

Laddove l’azione di PLC-β e PLC-γ porti alla liberazione di DAG sulla membrana e indirettamente di calcio nel citoplasma, quest’ultimo in rapporto alla sua elevata concentrazione va a legarsi a PKC a livello del dominio C2; questa interazione comporta una modificazione conformazionale di PKC per cui il dominio C1 si separa dal dominio C4 ed in alternativa prende contatto con DAG a livello della membrana plasmatica cosicché PKC si trasloca alla membrana plasmatica alla quale rimane legata non solo a mezzo di DAG ma anche a mezzo di fosfatidilcolina componente del foglietto lipidico della membrana, in quanto il calcio legato al dominio C2 di PKC e carico positivamente tende a stabilire legami con le teste polari cariche negativamente della fosfatidilcolina.

In contemporanea il dominio C4 di PKC ora libero interagisce con la proteina substrato ed in presenza di ATP presente sul dominio C3 di PKC la fosforila. Attiva, PKC è ora capace di fosforilare proteine di membrana coinvolte nel trasporto di calcio dall’esterno all’interno della cellula, sia proteine citoplasmatiche coinvolte in svariati processi cellulari tra cui alcune che in forma fosforilata possono raggiungere il nucleo dove concorrono al controllo dell’espressione genica e di conseguenza sortiscono effetti sulla crescita e differenziazione cellulare.

Substrato di PKC a livello della membrana plasmatica può essere lo stesso recettore che fosforilato diviene inattivo in quanto non più in grado di modificare la proteina Gq e pertanto perde la sua funzione di trasduttore di segnale, o alternativamente perde la sua azione tirosina cinasica. È inoltre da ricordare che PKC legata alla membrana diventa assai sensibile a sfingosina che a livello della membrana plasmatica può originare dal metabolismo degli sfingolipidi,