Medicina di laboratorio

Medicina di laboratorio

Importanza delle analisi di laboratorio

Spesso vengono prescritte analisi inutili, è bene dunque saper indirizzare il paziente verso gli esami di laboratorio più specifici e utili per abbassare anche le spese per la sanità. Un test appropriato è quello che serve per fare diagnosi e il cui rapporto rischio/beneficio è a favore dei benefici.

Biochimica

Medicina di laboratorio: studia l'effetto della malattia/terapia sulla biochimica degli organi tramite l'analisi di parametri misurabili.

Fluidi biologici: usati per tali diagnosi sono il sangue, urine che possono essere ottenute per raccolta (autonomamente) o per raccolta assistita (tramite catetere) e il campione si può dire estemporaneo (prime urine del mattino) o temporizzato (in tutto l'arco delle 24h esclusa quella della mattina); liquor, essudati, versamenti, liquido peritoneale, pleurico, pericardico, sinoviale.

Proteine e altre molecole

• Proteine: nel sangue ce ne sono 60-80g/L; se alterate potrebbe trattarsi di alterazioni epatiche oppure di dieta/assorbimento.
• Prodotti metabolici: tipiche sono l'azoto, marcatore sensibile e prodromico di un generico danno renale, e la creatinina, marker specifico tardivo di danno renale, prova della funzionalità renale.
• Danno cellulare: nel miocardio, la creatinchinasi (convertitore di creatina in fosfocreatina per accumulo energia nel muscolo) è un esempio, con tre forme: CK-MM (prevalentemente nello scheletrico), CK-MB (prevalentemente nel cardiaco), CK-BB (prevalentemente a livello cerebrale). Importanti sono gli isoenzimi, ciascuno dei quali è specifico per ogni tessuto e può avere ulteriormente isoforme diverse.
• Componenti cellulari: tipica la conta degli eritrociti, leucociti, piastrine, nel sangue per diagnosticare anemia, infezioni, leucemie etc.

Analisi spettrofotometrica

Spettrofotometro: una luce bianca visibile passa attraverso un filtro (monocromatore) che permette il passaggio solo di una certa lunghezza d'onda la quale sarà assorbita dalla sostanza disciolta nel campione biologico, i raggi che non vengono assorbiti vengono proiettati su un rilevatore che calcola l'assorbanza, ovvero il logaritmo del rapporto tra la luce incidente (iniziale) e quella trasmessa (finale), questo numero indica quante molecole erano presenti nella soluzione.

Spettrofotometria: utilizza il principio per il quale alcune molecole assorbono solo certi specifici colori, questo viene spesso utilizzato per distinguere due sostanze che assorbono la stessa onda. Ad esempio, il DNA e le proteine assorbono sempre onde da 280 nm, ma legando solo le proteine con dei coloranti aggiunti, allora leggerò solo la concentrazione di quest'ultimo sfruttando la sua peculiare ed unica onda assorbita.

Legge di Lambert-Beer

Legge di Lambert-Beer: A = εxlxc dove A = assorbanza; ε = coefficiente di assorbimento molare; l = spessore della soluzione; C = concentrazione in moli/L. Con tale formula ogni sostanza avrà una propria x-concentrazione y-assorbanza ottenuta curva di calibrazione con misurazioni successive utilizzando del materiale da calibrazione creato sperimentalmente. Da ciò, ogni volta che una data sostanza mostrerà una certa assorbanza in una soluzione, sarà possibile trovare per via grafica una stima della sua concentrazione. Tale meccanismo prende il nome di analisi quantitativa UV-VIS con la limitazione imposta dalle macchine che l'analita deve assorbire all'interno del range 200-900 nm.

Immunoturbidimetria e nefelometria

• Immunoturbidimetria: se la sostanza non assorbe luce, allora sarà legata a un anticorpo e il reticolo formato, a seconda della sua grandezza, piegherà la luce in modo più o meno intenso.
• Nefelometria-effetto Tyndall: diffusione di un'onda elettromagnetica che viene sia riflessa che rifratta da un colloide con particelle che hanno diametro nell'ordine di grandezza della lunghezza d'onda della radiazione. L'angolo della luce riflessa è in tutte le direzioni, ma l'intensità di ogni singolo angolo ci informa della sua concentrazione.

Fluorescenza e immunofluorescenza

Utilizziamo dei fluorocromi, sostanze che assorbono e ridanno le radiazioni a una certa lunghezza d'onda, associati spesso ad anticorpi che sono specifici. Citiamo la differenza tra la CK-MB-massa che lega la CK-MB come molecola, mentre la CK-MB-attività si contano quanti substrati vengono processati dall'enzima nell'unità di tempo.

Reazione end point o cinetica

Se ho una reazione che avviene ad una velocità altissima allora basterà vedere quanto colorante resta perché il legame proteina-colorante è una reazione immediata (studio di massa, più affidabile). Se invece la reazione di legame è lenta allora nella concentrazione devo inserire la variabile tempo e conoscendo tale velocità osservando in quanto tempo il substrato scompare o si produce il prodotto, posso predire la concentrazione sapendo che la velocità della reazione è inversamente proporzionale alla quantità dell'enzima (studio d'attività).

Potenziometria

Per dosare gli elettroliti. Si inseriscono nella soluzione degli elettrodi (specifici per ogni ione), infatti il legame tra lo ione e il polo genera una differenza di potenziale e se inseriamo tale valore nell'equazione di Nernst otteniamo la concentrazione.

Finestra diagnostica

È importante sapere quando una certa sostanza può raggiungere alti livelli nel sangue, ad esempio post-infarto subito troveremo mioglobina ma solo tardivamente la troponina. Altri esempi: PSA per diagnosticare il tumore della prostata; a livello legale per determinare la paternità; test antidroga, pazienti che devono monitorare un parametro per il resto della loro vita.

Pratico

È importante informare bene il paziente e prepararlo in maniera ottimale al prelievo del liquido biologico; oggi è tutto più computerizzato e per evitare confusione si consiglia di associargli i dati anagrafici, numero letto e il sospetto di diagnosi per permettere agli esaminatori di concentrarsi solo su alcuni parametri.

Come analizzare un campione biologico

Richiesta analisi, variabilità può essere biologica interindividuale o intraindividuale. Analisi dei materiali biologici: può essere un'operazione fisica, liquido amniotico, sangue, liquor versamenti raccolta: liquido seminale, feci, urina.

Procedure di analisi

NCCLS: ente del laboratorio che ha diviso in punti la raccolta. Scelta del campione, identificarlo, preparazione prelievo, contenitore, additivi, etichettatura.

Sistema vacu-tenier: la farfallina connessa alla provetta con dentro il vuoto senza siero: sangue con provetta anticoagulante. 3000 giri per 10 minuti recupera il siero: plasma senza fattori 8, 5 senza protrombina e fibrinogeno. Hanno microparticelle di silicio che stimolano la coagulazione, bisogna poi separare il siero dalla parte corpuscolare e si possono usare 2 metodi con plasma.

Preparazione del plasma

Sangue anticoagulante (EDTA = acido etile diamminotetracetico ed è un chelante degli ioni metallici, del calcio) dunque presenta i fattori di coagulazione e fatto centrifugare, otteniamo un sovranatante, globuli bianchi e piastrine e in fondo globuli rossi. C'è il rischio che le piastrine esprimano un antigene che reagisce contro le EDTA, il sodio citrato è un chelante reversibile del calcio e ha un rapporto volume sangue di 1:9, per contare PT e APTT. Usiamo 18 UI di eparina per 1 mL che lega la trombina, provette per il glucosio… lattato blocca la glicolisi….

Prelievo e interferenze analitiche

Durante il prelievo c'è rischio di emolisi per ago o per forza, porta a interferenza analitica perché ci sono sostanze che in ordine non c'erano come LDH, potassio, analisi in basse concentrazioni, sostanze che assorbono lo stesso spettro dell'emoglobina, rilascio di sostanze, influenza l'APTT e il D-dimero di molto. Potrebbe essere causato da emoglobinopatie, fragilità vascolare, inesperienza dell'operatore, agitazione della provetta.

Altri effetti

Effetto spazio morto: se misuro il sodio in campioni contenenti lipidi e proteine perché il sodio deve essere diluito e poi esaminato, ma la macchina non considera questo aumento.

Criteri di attendibilità

• Precisione: concordanza di analisi ripetute sullo stesso campione, con deviazione standard bassa, intervallo con fiducia (media deviazione -2ds).
• Accuratezza: concordanza tra il valore medio e il valore medio, l'inaccuratezza.
• Specificità: […]
• Sensibilità: […]
• Limite di rilevabilità: […]

Controllo di qualità

• Intralaboratorio: che rientra se tale variazione rientrano nei limiti accettabili, oppure possiamo.
• Esterno: sia tra più laboratori a partire dallo stesso campione e si realizza un grafico con nuovi valori standard, e se questi di un laboratorio si discostano troppo c’è un errore di sistema.

Abbiamo già visto che la variabilità pre-analitica deriva da un'alterazione nella conservazione del campione, ora invece parliamo della variabilità analitica che di quanto si discosta numericamente il valore riscontrato dal reale, non va però confuso con la variabilità biologica intraindividuale fisiologica che derivano dalle caratteristiche genetiche, di età, di salute, patologiche etc.

Inoltre esistono anche delle variazioni (circadiane, infradiane o ultradiane) di alcuni valori e che in media hanno un valore detto mesor ma che possono raggiungere apici detti acrofase e l’ampiezza è considerata la differenza tra questi due, per cercare di eludere il più possibile questa variabilità biologica facciamo il prelievo sempre nelle stesse condizioni e sempre alla stessa ora.

Condensare variabilità analitica e biologica (la variabilità analitica deve essere minore o uguale della metà della variabilità biologica intraindividuale) c’è la variabilità totale calcolata nel seguente modo: Vt=√(Va) +(Vb) che poi verrà moltiplicato per 2 2100, tale valore impatta per il 12% sul risultato finale. Dobbiamo anche considerare la differenza critica che si calcola Dc=2,77xVt e questo esprime di quanto deve variare un risultato in 2 misurazioni successive del medesimo analita affinché i due dati di laboratorio possano essere considerati diversi e dunque potenzialmente indici di patologia (con il 5% di possibilità di sbagliare).

Infatti, sul paziente dovremmo sicuramente fare un confronto trasversale ossia confrontare i suoi dati con i valori standard, ma dobbiamo anche fare un confronto longitudinale ossia confrontare 2 esami successivi sullo stesso paziente perché potrebbe essere indice di malattia anche un rialzo eccessivo purché nei limiti del normale. Facciamo l’esempio di una signora anziana che ha creatinina 0,7 mg/dL e in un giorno passa a 1 mg/dL (rimane pur sempre nei range della norma ma andiamo a vedere se supera la differenza critica), innanzitutto calcoliamo la Vt sapendo che la variabilità analitica della creatinina è del 3% e la variabilità biologica del 7%, troviamo che Vt=7,6% e ora dobbiamo fare la differenza critica ossia Dc=21%, a questo punto dobbiamo vedere in percentuale quanto si discostano i 2 valori facendo una proporzione 0,7:100=1:x e otteniamo che i due valori si discostano del 42%, dunque essendo 42 superiore a 21 concludiamo che questo aumento è patologico.

Valutazione degli intervalli di riferimento

Bisogna identificare una popolazione di riferimento composta da minimo 120 persone che non devono essere malate o avere fattori di rischio e devono esserci tanti maschi quante femmine di un'età compresa nel range che volgiamo analizzare, inoltre vanno stabiliti tutti i dettagli delle analisi: a che ora vengono effettuati, se seduti o in piedi, con che macchinari vengono utilizzati i campioni etc. Dopo aver eliminato i valori più estremi (outliers) dai risultati possiamo ottenere 3 grafici:

• Distribuzione gaussiana a campana: calcoliamo la media, la deviazione standard e calcolo l'intervallo di riferimento inferiore (media -2ds) e superiore (media + 2ds) e so che tra questi 2 valori sono contenuti il 95% di tutte le misurazioni.
• Distribuzione tipo skewed ossia asimmetrica a dx o a sx: facciamo un nuovo grafico dove mettiamo sulle ascisse i logaritmi dei valori trovati e sulle ordinate la frequenza e otteniamo una gaussiana (distribuzione log-normale).
• Distribuzione irregolare: dobbiamo effettuare dei tagli detti “percentili” ossia trovare per quale valore posso dire che il 25,50,75% dei risultati sono inferiori/superiori a quel valore scelto, dopodiché andrò a definire il limite inferiore al 2,5 percentile e il limite superiore al 97,5 percentile.

Concludiamo dicendo che ci sono i valori normali e i valori critici che sono al di fuori del normale, che dipendono dalla popolazione e da misurazioni su pazienti sani, mentre invece i valori decisionali o clinico ossia quelli oltre o sotto i quali è necessario che venga comunicato subito al medico affinché intervenga, quelli sono stabiliti dall’esperienza clinica e sono universalmente validi, c’è l’obbligo di segnalazione al medico anche qualora il valore rientrasse nel range del normale ma si superi la differenza critica.

Elettroliti

Le cellule vivono in un ambiente fisiologico (liquido interstiziale) che ha un determinato pH, osmolarità ed equilibrio elettrolitico, i principali elettroliti sono Na, K, Cl, Ca, P, Mg e la loro concentrazione differisce a seconda dello spazio che occupano ad esempio il sodio è molto più concentrato all'esterno della cellula (135-145 mEq/L) il che permette la trasmissione neuromuscolare, per non turbare questo equilibrio per idratare il paziente noi somministriamo una soluzione fisiologica endovena che è composta da acqua pura con 0,9% di NaCl.

Ipernatremia e iponatremia

Ipernatremia: la concentrazione non dipende tanto da quanto sodio effettivamente c’è nell’organismo (non da una dieta ipernatremica) quanto dalla quantità di solvente in cui è disciolto, ossia lo stato di idratazione del paziente, infatti l’aumento di sodio o la perdita di acqua (diarrea, malattia renale) aumenta l’osmolarità che stimola il rilascio di ADH e il senso di sete che spesso gli anziani non sono in grado di percepire andando così in ipernatremia.

Iponatremia: al contrario abbiamo stavolta un’intossicazione d’acqua o più raramente dieta iposodica o donne in gravidanza stavolta la riduzione della pressione osmotica fa raggrinzire i globuli rossi.

Iperpotassemia e ipopotassemia

Iperpotassemia: il potassio normalmente in sede extracellulare è poco concentrato (5 mEq/L) perché si trova molto più concentrato nelle cellule, dunque le sue variazioni non dipendono tanto dal solvente, bensì dalla necrosi delle cellule, l’iperpotassemia è infatti causata da un infarto intestinale, un'emolisi o un'embolia polmonare con conseguente infarto polmonare, l’aumento di questo ione porta a problemi cardiaci e respiratori.

Ipopotassemia: spesso causata da eccessiva perdita a livello renale, bisogna stare attenti anche ai farmaci.

Emogasanalisi

Si esegue su un prelievo arterioso generalmente all’arteria radiale o alla femorale anche se più profonda e va fatta solo dal medico o dall’infermiere perché ha come prerequisito il test di Allen ossia si fa chiudere la mano al paziente e si preme sull’arteria radiale di modo da occludere l’arteria, facendo schiudere la mano al paziente si osserva in quanto tempo la sola arteria ulnare è in grado di irrorare sufficientemente la mano in quanto il prelievo potrebbe ostruire l’arteria radiale.

Nell'EGA si misurano il pH (arterie 7,40 e vene 7,35) il quale viene regolato dal sistema tampone del sangue composto da acido carbonico e ione bicarbonato dove la CO₂ disciolta nel sangue reagendo con H₂O a formare H₂CO₃ è la principale responsabile dell’acidità del sangue e il rene ha il compito di eliminare H⁺ e riassorbire bicarbonati.

Siccome dopo il prelievo il sangue verrebbe a contatto con l’aria permettendo scambi gassosi, subito dopo il prelievo si deve chiudere la siringa e trattare con anticoagulante (fluoruro di sodio o ossalato di potassio che bloccano la glicolisi e dunque il consumo di ossigeno, già inseriti).

Viene misurata la pressione parziale di ossigeno che nelle arterie è di 80-100 mmHg, nelle vene di 40 mmHg.

Acidosi e alcalosi

• Acidosi metabolica: aumentano gli atti respiratori per eliminare la CO₂ in eccesso.
• Alcalosi metabolica: perdita di ioni H⁺ per vomito, ipovolemia, diuretici, ipokalemia e deficit renale di escrezione di bicarbonati.
• Alcalosi respiratoria: carenza di ossigeno, problemi al centro del respiro, ventilazione meccanica, pH aumentato, ridotta CO₂ e ridotto H₂CO₃.

Se la causa non è respiratoria può esserci compenso respiratorio che viene messo in atto fin dai primi minuti, mentre se il compenso è renale impiegherà più tempo per instaurarsi e infatti il paziente va seguito per più tempo.

Dislipidemie

Fattori di rischio: il Framingham Study è uno studio di coorte eseguito dall’università di Harvard di evidence-based medicine che ha redatto i principali fattori di rischio per le patologie vascolari e le prime due sono ipertensione e colesterolo, poi fumo, diabete, età, sesso, familiarità, stile di vita, obesità, dunque il colesterolo ha un ruolo centrale nelle patologie vascolari non tromboemboliche perché è il primus movens per la formazione della placca ateromasica.

Il colesterolo non è solubile in acqua e necessita di essere trasportato dalle lipoproteine (apoproteine + lipide) e questi sono i chilomicroni ricchi in trigliceridi e colesterolo.