Esame Medicina di laboratorio

ML 1: Biochimica clinica e variabilità del dato di laboratorio

Biochimica clinica

Nell'ambito della medicina di laboratorio, la biochimica clinica è incentrata sull'analisi di campioni di fluidi corporei, principalmente il plasma e altri fluidi quali urina, liquido pleurico e peritoneale, fluido cerebro-spinale e altri. Attraverso questi, studia l'effetto della malattia o dei farmaci sui processi biochimici degli organi, dei tessuti e dei fluidi biologici. A differenza della biochimica che ha l'intento di ricavare comportamenti e leggi generali, la biochimica clinica è interessata allo studio del singolo individuo ammalato. Da qui l'utilità delle emergenti scienze genomica, proteomica, farmacogenomica e metabolomica. Utilizza la misura delle eventuali alterazioni riscontrabili nei materiali biologici per raccogliere dati che abbiano valore di prove semeiologiche per confermare o smentire, insieme al clinico, l'approccio diagnostico.

Biomarcatori

La valutazione dei cosiddetti biomarcatori trova utilizzo nello screening (identificazione dei pazienti a rischio per definire test diagnostici di approfondimento o un intervento preventivo), nella diagnosi, nella stratificazione del rischio (identificazione di sottogruppi di pazienti che possono trarre benefici o danni da un particolare trattamento), nel monitoraggio (in particolare nella modulazione della dose e monitoraggio della durata del trattamento), nonché nel ruolo di endpoint surrogato (misura più sensibile del trattamento, sostitutiva di una diretta valutazione dell'esito clinico del trattamento nel paziente).

Variabilità del dato di laboratorio

Variabilità pre-analitica (legata al paziente o alla conservazione del campione)

Una serie di fattori legati all'individuo possono essere responsabili del fatto che i valori di un parametro analitico possano variare nello stesso individuo, anche se non sono intervenute patologie, oppure siano differenti da soggetto a soggetto. In qualsiasi momento, la concentrazione di una sostanza in un liquido biologico è il risultato di un equilibrio dinamico. La variabilità biologica è la fluttuazione naturale attorno al proprio punto omeostatico all'interno di un fluido biologico. Il valore di concentrazione all'equilibrio viene denominato punto omeostatico. Tale variabilità casuale prende il nome di variabilità biologica intra-individuale o CVi. Esiste anche una variabilità biologica inter-individuale o CVg, cioè una variabilità tra individui diversi.

• Influenze fisiologiche a breve termine: Ritmi circadiani, dieta, postura, fase REM (relazione con il sonno), ciclo mestruale, ingestione recente di cibo, esercizio fisico, assunzioni di farmaci, disturbi del sonno, stati d'ansia, affaticamento fisico, immobilizzazione forzata.
• Influenze fisiologiche a lungo termine: Gravidanza, massa corporea, razza, età, sesso, tipo di attività lavorativa e classe sociale, localizzazione geografica, tabagismo.

Ruolo degli SNPs (polimorfismi) nella predisposizione alla malattia

Il fenomeno del polimorfismo genetico influenza la suscettibilità a malattie multifattoriali (es. cancro, malattie cardiovascolari, aterosclerosi, diabete, artrosi, etc.) che sono determinate da un concorso causa gene-ambiente.

Rischio = Tossicità x Esposizione x Suscettibilità

Una mutazione a carico di uno specifico gene viene ereditata e può essere sufficiente a determinare l'insorgenza di una condizione patologica. Il loro riscontro consente di selezionare soggetti per diverse finalità: diagnosi precoce, selezione sulla base di fattori predisponenti alle malattie, o selezione sulla base di fattori responsabili di una diversa risposta al trattamento (terapia personalizzata).

Su cosa ricadono gli effetti della variabilità biologica?

Rilevanza analitica: La riduzione degli errori richiede precisione, accuratezza, e controllo dell'errore totale.

Rilevanza interpretativa: Richiede una differenza critica, l'uso di intervalli di riferimento e una valutazione e confronto dei valori osservati.

Variabilità analitica, legata al metodo di analisi

L'attendibilità di un metodo analitico dipende da diversi fattori, tra cui i principali sono: l'accuratezza, la precisione, la sensibilità e la specificità. L'operatività del laboratorio presuppone una serie di procedure in grado di garantire l'affidabilità, cioè il sicuro significato dei dati che fornisce. Tali procedure conferiscono il controllo di qualità dei risultati e presuppongono i criteri analitici dell'accuratezza e della precisione, oltre al criterio clinico della plausibilità.

Errore totale e attendibilità

Se si eseguono più misurazioni di una stessa quantità, raramente le misure coincidono. Si conclude ovviamente che i valori misurati sono in genere diversi dal vero valore della quantità oggetto di misura. La differenza tra il valore misurato (x) e quello vero è detta errore totale. L'attendibilità esprime la capacità della misura in esame di approssimare il valore vero.

Errori di misura

Errori grossolani: Sono quelli commessi in seguito a un'inappropriata applicazione del metodo analitico.

Errori sistematici: Rappresentano la tendenza di un dato metodo a sovrastimare o sottostimare il vero valore. Gli errori sistematici hanno cause ben determinate, inerenti al metodo (es.: scarsa selettività del reagente usato per la titolazione di un certo soluto), o alle condizioni di esecuzione del procedimento analitico (es.: strumento non calibrato correttamente).

Errori casuali: Sommano tutte le piccole e imprevedibili variazioni nell'esecuzione delle varie operazioni analitiche. L'imprecisione è la dispersione tra misure ripetute rispetto a un valore medio (allontanamento dalla media) e riflette l'errore casuale. Si valuta analizzando lo stesso campione più volte.

L'inaccuratezza può essere definita come la differenza tra il valore misurato e il valore vero. È dovuta alla presenza di un errore sistematico del metodo adottato. In pratica il controllo si effettua utilizzando sieri di controllo, cioè campioni appositamente predisposti con quantità note di vari componenti e sottoposti ad analisi contemporaneamente ai sieri dei pazienti. La concordanza tra i valori analitici e quelli noti dei composti usati come calibratori garantirà la correttezza analitica dei risultati.

Ripetibilità e riproducibilità

Il concetto di precisione include quello di ripetibilità e riproducibilità.

Ripetibilità: È la misura della deviazione dal valore medio dei risultati ottenuti da uno stesso operatore in un’unica serie analitica e senza cambiare reattivi o apparecchiature (precisione entro la serie).

Riproducibilità: È la misura della deviazione dal valore medio dei risultati ottenuti in un arco variabile di tempo da operatori diversi che non conoscono l'identità del campione analizzato e che usano lotti di soluzioni e reagenti diversi.

Statistica dei dati analitici

• Media aritmetica: È una stima del valore centrale attorno a cui oscillano i valori trovati.
• Moda: Rappresenta, in una distribuzione di frequenze di un dato parametro in una popolazione, il valore che presenta la massima frequenza.
• Mediana: È il valore centrale di una distribuzione di frequenze ordinate in modo crescente o decrescente.
• Deviazione standard: Indica di quanto in media le singole osservazioni si discostano dalla media aritmetica.

Se la distribuzione è statisticamente normale, i valori di riferimento vengono arbitrariamente fissati come pari alla media +/- 2 deviazioni standard (S.D.). Circa il 95% della popolazione sana viene incluso nell'intervallo di riferimento. Se la distribuzione non è statisticamente normale (cioè non è descrivibile con una gaussiana) e non si può rendere normale con procedimenti matematici, si usa prendere un limite inferiore come il percentile 2,5% e un limite superiore come quello del 97,5% degli individui affetti dalla patologia.

I risultati sono entro l'ambito dei limiti di riferimento?

È importante capire come si giunge alla determinazione dei valori di riferimento per ogni analita. La corretta interpretazione dei dosaggi di laboratorio dipende da un'adeguata conoscenza dei valori riscontrati in una popolazione “sana” e degli intervalli attesi per i parametri desiderati.

Affidabilità vs. validità

Affidabilità: Si intende la capacità del test di offrire sempre lo stesso risultato nel corso di misurazioni ripetute.

Validità: La capacità del test di distinguere in una popolazione i soggetti sani da quelli malati.

Lo studio approfondito di tutti quei fattori che sono in grado di modificare o semplicemente influenzare la produzione di idonei intervalli di riferimento ha dato un notevole contributo al chiarimento dei dati stessi di laboratorio.

Determinazione degli intervalli di riferimento

• Effettuare il dosaggio su un vasto numero di soggetti.
• Raggruppare i soggetti per sesso ed età.
• Scegliere soggetti senza malattia in atto.
• Eseguire le determinazioni a digiuno.
• Le tecniche di prelievo devono essere standardizzate (es. anticoagulante, uso corretto del laccio emostatico).
• Metodi di dosaggio uguali per tutti i soggetti analizzati.

Intervallo di riferimento: Si definisce come quello in cui ricade il 95% dei valori misurati sul campione preso come riferimento (se si ha una distribuzione gaussiana di parametri analitici, in cui moda, media e mediana coincidono). Il 2,5% dei valori alti e il 2,5% di quelli bassi costituiscono i valori “sospetti”; oltre i +/- 2DS si hanno valori patologici.

Alcuni parametri biochimici possono seguire una distribuzione a campana, ma asimmetrica (non normale); si passa a scala logaritmica sulle ascisse e si rientra nel caso della distribuzione gaussiana. Se ciò non è possibile si passa alla ricerca di una soglia di separazione tra soggetti sani e malati sulla base di sensibilità e specificità cliniche che la ricavano dal confronto tra rischio di veri e falsi positivi: è definita da Murphy & Abbey come “le migliori linee in grado di separare i ‘normali’ dai ‘malati’ o selezionare coloro per i quali è necessario proseguire negli accertamenti da quelli che non lo richiedono.

Livelli decisionali

Si possono individuare alcuni valori soglia, che il medico può usare per operare determinate scelte cliniche (donde il nome di livelli decisionali) ogni volta che il risultato di un test si collochi sopra o sotto il valore soglia. I livelli decisionali corrispondono a valori limite (universalmente accettati) utilizzati per confermare o meno l'appartenenza di un determinato paziente a una definita categoria clinica.

Principali differenze tra intervalli di riferimento e limiti decisionali: Es. Valori di colesterolo superiori ai valori decisionali, ma comunque non particolarmente elevati, possono essere associati a patologie, ma anche a una dieta fortemente sbilanciata. In questi casi è opportuno effettuare una valutazione degli esami di II scelta.

Quando si dosa il colesterolo sierico, esso rappresenta la somma di quello contenuto nelle diverse lipoproteine, per cui non abbiamo un'informazione completa sull'eventuale rischio di sviluppare malattie cardiovascolari dovute all'accumulo di colesterolo nei tessuti. Quindi, nei soggetti che mostrano livelli di colesterolo moderatamente superiori ai valori decisionali, è utile il dosaggio del colesterolo contenuto nelle diverse lipoproteine.

Curve ROC (Receiver Operating Characteristics)

Il punto di discriminazione più conveniente di un test si ricava dalle curve ROC (Receiver Operating Characteristics). La curva ROC permette di identificare il valore soglia ottimale (il cosiddetto best cut-off), cioè il valore del test che massimizza la differenza tra i veri positivi e i falsi positivi.

Confrontando ad esempio i valori glicemici rilevati in un campione di soggetti diabetici con quelli in un campione di controllo di soggetti sani, è possibile costruire una tabella di contingenza in cui registrare il numero di soggetti malati (veri positivi e falsi negativi) e non malati (veri negativi e falsi positivi) e a partire da questo costruire un grafico rappresentato da due curve in un sistema di assi cartesiani.

• La situazione ideale vedrebbe una netta distinzione tra soggetti sani e malati, con le due curve nettamente separate e la curva che rappresenta la relazione tra veri positivi e falsi positivi spezzata (non continua, nessuna associazione).
• L'evenienza peggiore vedrebbe una totale sovrapposizione tra soggetti sani e malati pertanto indistinguibili, nonché una correlazione lineare tra veri e falsi positivi. In questo caso occorre modificare il test o il campione.
• Più frequenti sono le situazioni intermedie, in cui la curva che esprime la dipendenza tra veri e falsi positivi mostra dapprima una correlazione lineare e poi assume un andamento iperbolico: il punto di flesso di questa curva, calcolabile matematicamente, permetterà di individuare il best cut-off.

I risultati dei miei esami sono diversi da quelli ottenuti in passato?

I referti sono in genere accompagnati da una valutazione “storica” della determinazione in questione. La differenza tra due risultati analitici ottenuti in tempi diversi su uno stesso paziente è statisticamente significativa con una probabilità del 95% se è uguale o supera il valore della cosiddetta “differenza critica” definita matematicamente.

Conclusioni

Importanza delle linee guida per l'individuazione e delimitazione di opportuni intervalli di riferimento (fattori di variabilità biologica, fisiologica). I limiti di riferimento sono destinati a svolgere un ruolo importante come guida nell'interpretazione dei risultati per la maggior parte degli analiti, ancora privi di livelli decisionali. Il laboratorio è atteso a dare un supporto fondamentale al clinico.

Variabilità post-analitica

In questi ultimi due decenni, molti sforzi sono stati compiuti nell'ambito dei laboratori di analisi cliniche per raggiungere la cosiddetta qualità totale ottenuta da miglioramenti nelle tre fasi: pre-analitica (ottimizzazione del prelievo e della conservazione del campione), analitica (precisione e accuratezza delle misurazioni) e post-analitica (refertazione).

ML 2-3: Valutazione della funzionalità epatica

Funzioni metaboliche del fegato

Il fegato svolge un ruolo centrale nel metabolismo di carboidrati, lipidi, proteine, eme, deposito di ferro (Fe) e vitamine liposolubili, sintesi di fattori di coagulazione e detossificazione. È un organo altruista con centralità funzionale data dalla grande flessibilità metabolica: la modulazione dell'espressione degli enzimi avviene a una velocità 5-10 volte superiore a quella degli altri tessuti. Tramite la vena porta raccoglie il sangue refluo dagli organi della digestione.

Si occupa quindi del metabolismo di numerose sostanze che, sia come nutrienti che come prodotti terminali di altri metabolismi, giungono al fegato attraverso la circolazione ematica. In particolare, il suo corredo enzimatico (inducibile e costitutivo) lo rende organo glucostatico: controlla gli sbalzi glicemici tra periodo post-prandiale e digiuno, conservando, nel primo caso, glucosio sotto forma di glicogeno (grazie alla G6P-fosfatasi e gli enzimi della glicogenogenesi) e creando depositi di trigliceridi, oppure nel secondo caso liberando in circolo glucosio immagazzinato (glicogenolisi) o neosintetizzato (neoglucogenesi).

N.B. Anche il muscolo scheletrico è capace di una neoglucogenesi, anche se incompleta in quanto destinata al proprio stesso consumo (con formazione di G6P e non di glucosio libero).

In esso avviene poi il fondamentale ciclo dell'urea, per il metabolismo delle proteine e di tutti i composti azotati con il duplice scopo energetico e di riduzione dei livelli di ammonio circolante. Infine, il metabolismo dei lipidi riguarda in particolare la possibilità di formare molecole di natura steroidea (ormoni, sali biliari) che consentono di metabolizzare ed allontanare il colesterolo (non completamente catabolizzabile).

È del tutto evidente che analisi o misure relative ad alcune di queste sostanze possono risultare particolarmente indicative dell'integrità strutturale e funzionale del fegato; queste indagini di laboratorio sono quindi finalizzate a mettere in evidenza marcatori di funzionalità epatica e marcatori di danno epatico, definiti prove di funzionalità epatica.

Esami di primo livello

In considerazione delle numerose funzioni svolte dal fegato e dell'onere che può derivare da una richiesta di numerosi parametri, potenzialmente improduttiva per una diagnosi, in un primo momento si valutano, come esami di primo livello:

• La bilirubina, totale e frazionata
• Gli enzimi (transaminasi, fosfatasi alcalina, gamma-glutamiltranspeptidasi)
• Le proteine plasmatiche, o meglio del siero (albumina e globuline)
• I fattori della coagulazione (tempo di protrombina, tempo di tromboplastina parziale)

I marcatori biochimici per lo studio del fegato possono essere così suddivisi: funzionalità e danno.

Coniugazione: Bilirubina totale e frazionata (coniugata)