Meccanismi di riparo del DNA, Microbiologia

I meccanismi di riparo del DNA

La prima slide ci fa vedere come ceppi batterici possono sopravvivere meglio o peggio ad agenti che danneggiano il DNA. Questo è un tipico esperimento in cui noi possiamo prendere dei batteri ed esporli a degli agenti che danneggiano il DNA, sia agenti chimici o fisici, facciamo sempre l'esempio dei raggi ultravioletti, e dopo l'esposizione andare a fare quella che viene chiamata curva di sopravvivenza.

Cosa vuol dire? Vuol dire prendere delle aliquote, ormai siete espertissimi a fare le CFU, quindi vuol dire fare le CFU, fare una conta vitale. Quindi a dosi crescenti del nostro trattamento andiamo a vedere quanti batteri sopravvivono.

Se noi facciamo questo con ceppi batterici diversi, in particolare qui abbiamo quello che viene definito Wild Type e qui abbiamo il mutante, o magari ceppi batterici diversi solamente, non so, possiamo vedere che ci sono delle curve diverse. Quindi il fatto che ci siano delle curve diverse ci sta ad indicare, curve diverse di che? Di sopravvivenza ad un determinato trattamento, che ci sono diciamo batteri che possono sopravvivere meglio e batteri che invece sopravvivono peggio.

In particolare in questo grafico viene riportato il confronto tra un ceppo WT e un ceppo mutante, e noi vediamo che il mutante è più sensibile all'agente genotossico. Questo che cosa ci porta a concludere, pensando in termini genetici, ci porta a concludere che il mutante avrà disattivati dei pathway che servono a sopravvivere a quell'agente mutageno.

Se l'agente è un agente genotossico, è un agente che determina delle aberrazioni a livello del DNA, possiamo concludere che il mutante avrà disattivati dei meccanismi di riparo del DNA e indirettamente possiamo concludere che esistono dei meccanismi di riparo del DNA. Quindi in soldoni diciamo che questo tipo di risposta è atteso quando esistono dei meccanismi di riparo, quindi quando noi li eliminiamo abbiamo una ridotta sopravvivenza.

Questa è la solita tabella con una serie di geni di E. coli coinvolti nel meccanismo di riparo, vedete è una tabella molto lunga che ci sta ad indicare che i meccanismi e anche le funzioni geniche sono diverse e quindi questo ci sta ad indicare che i meccanismi di riparo del DNA sono molteplici e quindi la storia è abbastanza complicata.

Meccanismi specifici e generali

In generale, possiamo suddividere i meccanismi di riparo del DNA in meccanismi specifici e meccanismi più generali. Definiamo i meccanismi specifici quei meccanismi che vanno a riconoscere una specifica lesione e a correggerla; i meccanismi aspecifici non hanno una determinata specificità per una particolare lesione, per esempio una base deaminata, ma riconoscono per esempio una distorsione della doppia elica.

Eliminazione delle basi deaminate

I meccanismi specifici sono diversi, il primo che andiamo a vedere riguarda meccanismi che vanno a eliminare in maniera selettiva le basi deaminate. Qui vi ho messo degli esempi di deaminazione di basi.

Allora la deaminazione vuol dire la rimozione del gruppo aminico -NH2. Cosa succede se io elimino il gruppo aminico dalla citosina? Vuol dire che la citosina invece di quell'-NH2 avrà un ossigeno e quindi dalla citosina mi passa ad uracile. Se una citosina mi passa ad uracile una base di tipo GC mi diventa AT.

La stessa cosa se elimino il gruppo aminico dall'adenina questa mi diventa inosina e quindi AT mi diventa GC. Dalla guanina tolgo il gruppo aminico e posso avere AT e AT, perché la guanina deaminata mi può dare la xantina o l'oxo-guanina. Questo tipo di alterazione se non viene corretta quindi mi determina una mutazione. Io passo da qui a qui, es. AT->GC, quando non ho correzione.

Esistono però degli enzimi che sono capaci di rimuovere in maniera specifica le basi deaminate. Qui vi ho solo messo per ricordarvelo, forse lo ricordate meglio di me, questo è il legame glicosidico. Il legame glicosidico è il legame che tiene legata la base allo zucchero.

Perché dobbiamo prendere in considerazione il legame glicosidico? Perché per rimuovere la base deaminata noi utilizziamo degli enzimi che vengono chiamati DNA-glicosilasi, sono degli enzimi che tagliano in maniera specifica quel legame glicosidico.

Ma dove lo tagliano? Non lo taglieranno sempre perché se lo tagliano sempre distruggerebbero tutto il DNA, tagliano il legame glicosidico della base deaminata.

Quindi, se questa è la doppia elica e questa una base deaminata, l'N-glicosilasi la riconosce e rimuove la base deaminata. Ma non può finire lì perché se rimuovo la base deaminata io ottengo un sito AP, apurinico o apirimidinico, un sito senza base.

Allora ecco che subentra un altro enzima, l'endonucleasi apurinica, che riconosce il sito che ha perso la base e lo taglia. Cosa taglia? Taglierà lo scheletro fosfato-zucchero e quindi a questo punto determina un gap.

Quando siamo arrivati al gap siamo a posto perché una volta che noi abbiamo un gap abbiamo la DNA polimerasi I, vi ricordo è la riparativa, che copia quindi sintetizza l'informazione mancante utilizzando come stampo il filamento omologo continuo, poi ci saranno le elicasi che richiudono e quindi in questo modo noi abbiamo riparato la lesione.

Le N-glicosilasi sono diverse e sono tante quante sono le diverse basi deaminate. In E. coli è molto importante questo meccanismo di riparo e ve ne accorgete dal fatto che sono state isolate ad oggi una dozzina di N-glicosilasi, almeno 12 diverse, quindi vuol dire che il sistema è molto utile e si sono selezionati nell'evoluzione tutta una batteria di enzimi che fanno questo lavoro.

Questo meccanismo a due step può essere operato anche da un altro tipo di enzima, le AP liasi. Le AP liasi hanno entrambe le attività, cioè vi rimuovono la base deaminata e il sito apurinico.

Quindi la lesione, questo tipo di lesioni, cioè l'eliminazione delle basi deaminate, può avvenire in 2 step o con delle glicosilasi a cui segue l'attività delle endonucleasi apuriniche oppure utilizzando queste AP liasi che hanno entrambe le attività.

VSP: very short patch repair

Questo meccanismo che viene chiamato VSP, very short patch repair, è un meccanismo particolare che rientra sempre nei meccanismi di riparo delle basi deaminate. È particolare perché è rivolto alla correzione di una particolare base deaminata che è la 5-metil-citosina.

Voi sapete che molti organismi, forse in tutti gli organismi, esistono questi meccanismi di modificazione del DNA post sintesi e consistono proprio nel modificare le basi aggiungendo dei gruppi metilici, questo esiste sia nei procarioti che negli eucarioti.

Negli eucarioti per esempio la metilazione dei promotori, che cambiano forza quando sono più o meno metilati. Nei procarioti esistono delle metilasi; un altro sistema che utilizza la metilasi è per esempio la difesa dagli enzimi di restrizione.

Avete studiato gli enzimi di restrizione e possiamo considerarlo un meccanismo immunitario dei batteri, quindi un batterio che produce un enzima di restrizione si deve difendere. EcoRI, che è l'enzima prodotto da E. coli, si deve difendere da quell'enzima, e come si difende? Metilando i siti riconosciuti dall'enzima di restrizione.

Quindi la metilazione è un processo importante di difesa, però cosa succede se una base metilata viene deaminata? Allora nel caso della 5-metil-citosina, non vi ho fatto tutto il percorso, ma allora la deaminazione della 5-metil-citosina porta ad una variazione del codice genetico delle basi da GC ad GT.

Praticamente quello che succede è che se io deamino la citosina produco la timina, la timina essendo una normale base per il DNA non può essere riconosciuta da nessuna N-glicosilasi, non esiste una N-glicosilasi che riconosce la timina, quindi se non si potesse correggere questo errore si avrebbe per forza una mutazione.

Invece esistono dei siti particolari che sono questi con questa sequenza: CCmWGG, W=AT o TA. Se io mi trovo una metilazione nella seconda citosina e la seconda citosina metilata si deamina subentra questo meccanismo VSP.

VSP in realtà è un'endonucleasi che riconosce in maniera specifica la 5-metil-citosina deaminata che ora è una timina, in questa sequenza, ci si lega, la taglia, si forma un gap che poi viene riparato dalla polI.

Quindi a questo punto se noi prendiamo in considerazione i difetti dovuti alla deaminazione della base facciamo due sottoclassi: una classe più generale in cui la riparazione avviene ad opera delle glicosilasi ed endonucleasi apuriniche o AP liasi e una seconda classe di danno molto specifico riconosciuto da questo VSP, che consiste nel riconoscimento di una metil-citosina deaminata presente in maniera specifica in questa sequenza.

Danni causati dai ROS

La seconda classe di danni che prendiamo in considerazione e quindi di meccanismi di riparo di questi danni, sono i danni causati dai ROS. Questi sono una serie di elementi che fanno parte di questa famiglia, ROS sta per Reactive Oxygen Species, specie reattive dell'ossigeno, sono composti altamente reattivi perché hanno almeno un elettrone in più