Concetti Chiave
- La semina in piastra prevede l'uso di substrato MRS agar autoclave e diverse diluizioni a seconda della fonte, con incubazione a 37°C per 72 ore.
- La tecnica di semina in doppio strato consente di isolare sia lattobacilli che batteri propionici, utilizzando un mix di substrato e diluizione con incubazione a 37°C per 48-72 ore.
- Per l'analisi delle provette, si prepara una soluzione nutritiva e si seminano 10 ml di latte non diluito, incubando a 80-82°C per 10-12 minuti per eliminare le forme vegetative.
- La presenza di clostridi viene indicata dal sollevamento del tappo di paraffina nelle provette, causato dalla produzione di gas durante la fermentazione.
- Il substrato di coltura si presenta di colore giallo con paraffina trasparente sopra, che solidifica nuovamente raffreddandosi, facilitando l'osservazione delle colonie.
Come si effettua la preparazione del substrato e semina?
Si può fare sia nel latte che nel siero.
1. Semina in piastra
-Si prepara il substrato di MRS agar (parzialmente selettivo) in beuta, poi si mette in autoclave come già precedentemente descritto.
-Semina delle diluizioni, si utilizzano diluizioni 10-5/10-7 per il latte da Parmigiano Reggiano, 10-6/10-9 per il siero, 10-2/10-3 per il latte alimentare. In piastra si mette 1 ml di diluizione, poi il substrato. Si fa raffreddare, poi si mettono le piastre capovolte in termostato.
-Incubazione a 37°C per 72 ore.
-Conteggio, con i metodi già precedentemente descritti.
2. Semina in doppio strato.
Tecnica di semina in doppio strato
-Si mettono in piastra 15-20 ml di substrato e si lascia solidificare.
-Si mette 1 ml di diluizione e altri 15-20 ml di diluizione, si mescola il tutto.
-Incubazione in termostato a 37°C per 48-72 ore.
Con questa tecnica oltre ai lattobacilli si isolano anche i batteri propionici. Le colonie a occhio nudo non si distinguono, quindi bisogna versare acqua ossigenata nella piastra, e le colonie di batteri propionici creano effervescenza.
È una ricerca qualitativa, ma va bene in quanto nel Parmigiano Reggiano non devono essere presenti.
Preparazione e analisi delle provette
-In una beuta si prepara una soluzione nutritiva, con acqua distillata, lattato di sodio, acetato di sodio ed estratto di lievito.
-Si preparano le provette per l’analisi, in cui si inserisce 1 ml di soluzione nutritiva, 1 cubetto di paraffina e si tappa il tutto con del cotone da laboratorio.
-Le provette si mettono in autoclave per 15 minuti a 121°C. Una volta estratte il substrato è sul fondo, di colore giallo, mentre la paraffina è sciolta, ed è trasparente al di sopra del substrato. Raffreddandosi la paraffina diventa bianca e solidifica.
-Si seminano direttamente 10 ml di latte non diluito nella provetta, e si mettono le provette a 80-82°C per 10-12 minuti. A questa temperatura vengono uccise tutte le forme vegetative e sopravvivono solo le spore. La paraffine si scoglie nuovamente e il latte si mescola al terreno di coltura.
-Una volta estratte le provette la paraffina solidifica di nuovo. Si mettono le provette ad incubare in termostato per 48 ore, e si segna il limite inferiore. Se il latte non aveva clostridi il tappo di paraffina rimane fermo, mentre se erano presenti questi producono gas determina il sollevamento dei tappi di paraffina.
Domande da interrogazione
- Qual è la procedura per la semina in piastra del substrato di MRS agar?
- Come si utilizza la tecnica di semina in doppio strato?
- Qual è il ruolo della paraffina nelle provette per l'analisi?
- Quali sono le condizioni di incubazione per le provette preparate con latte non diluito?
La semina in piastra prevede la preparazione del substrato di MRS agar in beuta, la sterilizzazione in autoclave, l'aggiunta di 1 ml di diluizione e l'incubazione a 37°C per 72 ore.
Nella semina in doppio strato, si solidifica il substrato in piastra, si aggiunge 1 ml di diluizione e altri 15-20 ml di substrato, mescolando il tutto, e si incuba a 37°C per 48-72 ore, permettendo di isolare anche i batteri propionici.
La paraffina, inserita nelle provette con la soluzione nutritiva, si scioglie durante l'autoclave e solidifica nuovamente dopo la semina del latte, fungendo da indicatore per la presenza di clostridi in base al sollevamento dei tappi.
Le provette con 10 ml di latte non diluito vengono incubate a 80-82°C per 10-12 minuti per uccidere le forme vegetative, seguite da un'incubazione in termostato per 48 ore per l'analisi della presenza di clostridi.
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