Istopatologia

Istopatologia

Lezione 1 - Intro e overview

Lezione 2 – Fissazione, inclusione, taglio, EE

Struttura di un lab di anatomia patologica: lab che effettua diagnosi delle patologie → si occupa di immunoistochimica (se vengono espressi marcatori di tipo vario), patologia molecolare, FISH, PCR.

I laboratori che se ne occupano sono: citologia (liquidi a cui si estraggono e analizzano le cellule), istologia, criotomia (si congela campione per dare risposta in poco tempo 15/20 min) + autopsie, che con il tempo stanno diventando una cosa a sé.

Ogni cosa tolta durante un’operazione (prelievo), viene analizzata dall’anatomia patologica (→ interagisce con reparti). Anatomia patologica ≠ medicina legale: anatomo patologo cerca la causa di morte principalmente naturale, se c’è sospetto di morte non per causa naturale si sospende l’autopsia che passa alla medicina legale.

Flusso di lavoro in anatomia patologica

1. Accettazione, da parte del tecnico di lab di anatomia patologica; tecnico riceve campioni da strutture ospedale, fa controlli, codice a barre, dati paziente, guarda campione per verificare se vede il campione e se si tratta di quello descritto dal foglio che arriva insieme al campione (ad esempio arriva fegato e nel foglio c’è scritto intestino), quindi si guarda forma, colore, ecc, e se conforme viene mandato avanti altrimenti viene segnalata una non conformità.
2. Descrizione macroscopica e dei dettagli del campione.

In anatomia patologica arrivano tessuti e cellule, arriva il tessuto nello stato in cui era presente nel paziente, ma non è più irrorato dai vasi e quindi va incontro a degenerazione del tessuto, quindi il campione deve essere conservato (tramite fissazione o si può usare anche criocongelamento), e nella routine fissato, che quindi fa mantenere al tessuto la morfologia e la struttura (mentre il congelamento può modificare il campione dato che per congelamento si possono formare dei cristalli e si possono rompere le cellule) quindi manteniamo in questo caso: morfologia e struttura, parte enzimatica e antigenica.

Fissazione

Fissazione avviene per reazione tra fissativo e molecole del tessuto mantenendolo nello stato più vicino alla condizione fisiologica/fisiopatologica → obiettivi:

• Impedire autolisi dei tessuti e crescita microrganismi.
• Fissare tessuti in modo che non cambino volume e forma durante processazione.
• Preparare tessuto e lasciando in condizione (integra) che permette colorazione delle sezioni.
• Mantenere tessuto vicino al suo stato di vita per non perdere nessuna molecola, nel tempo.
• Rendere il tessuto inalterabile.

*Formalina, fissativo per eccellenza, antibatterico e antifungino.

Fissativi ce ne sono tanti, ma nella pratica clinica usato solo (formalina), economico, facile da usare, fissa bene, ma è cancerogeno.

In anatomia patologica si ha un potenziale rischio biologico: il problema microbiologico si presenta solo quando arrivano tessuti a fresco, altrimenti gli altri sono tutti sotto formalina che è antimicrobico; e un potenziale rischio chimico, confinato alla fissazione. Sono barattoli per i campioni che quando chiudi schiacci bottone che fa scendere la formalina e ogni tanto dentro c'è anche l'olio che essendo immiscibile con la formalina rimane in superficie e non la fa evaporare.

Come viene bloccata la lisi cellulare? Praticamente la formalina forma dei legami, un reticolato tra le proteine dei tessuti in modo da formare una rete e bloccare tutto, quindi anche occupare le tasche degli enzimi.

Fattori che influenzano la fissazione

Fattori che influenzano la fissazione: fissazione è processo che blocca l'autolisi.

Principale fattore: penetrazione del fissativo, a cui partecipano altri fattori come pH, tempo, temperatura → la parte superficiale sarà più fissata, l'H₂O andrà verso l'interno, ma comunque la formalina raggiunge l'interno del tessuto → tempo, se non lascio abbastanza il tessuto in formalina necrosi dei tessuti centrali in cui si sono attivati enzimi per morte e degenerazione cellulare.

Aumentando temperatura aumenta anche la velocità di propagazione della formalina, ma aumenta anche attività enzimi litici, perciò, si abbassa la temperatura per rallentare sì il fissativo, ma molto di più gli enzimi litici.

Ma (biopsia prostatica è sottilissima quindi posso alzare la temperatura senza deteriorare il campione essendo esso molto piccolo, ci mette meno la formalina a bloccare tutto che gli enzimi litici ad attivare e degradare il tessuto).

Le temperature utilizzate: tra 0-4°C (se creo situazione di sottovuoto blocco quasi totalmente enzimi litici, con buste sottovuoto).

pH ottimale, pH 6-8, vengono utilizzati sistemi tampone.

Esempio: tessuto tumorale grande e troppo morbido da tagliare (faccio qualche taglio profondo per far arrivare subito la formalina anche al centro), prefissazione di 2/3 ore per permettermi di fare prelievo perché tessuto un po' più rigido, e poi rimette a fissare (penetrazione del fissativo garantisce buona fissazione).

Fissativi: si usava anche il mercurio, ma ora si usano formalina (formaldeide) > paraformaldeide > glutaraldeide (→ in ordine di velocità, perciò formalina più usato) → spessore del campione è ovviamente fondamentale, dimensioni per biocassetta, quindi prelievo: 2 lungh x 2 largh x 0,5 di spessore cm.

Tempo:

• Ipofissazione, mi fa perdere sia antigenicità (perché antigene non c'è più, per lisi) e mi fa perdere morfologia → necrosi tessuto.
• Iperfissazione, problema antigenico (fissativo blocca antigene proteico e punti a cui l'anticorpo si sarebbe legato perciò non si può legare, l'antigene è quindi mascherato dal fissativo).

Formalina è il gold standard, fissativo per eccellenza dell'istologia.

Formalina in natura è un gas, non esiste al 100%, dipende quindi quanto posso saturare la soluzione, io posso saturare una concentrazione fino al 40% → in lab si usa 10% (del 40%) quindi la concentrazione della soluzione di lavoro è al 4%.

Amminoacidi della formaldeide: lisina, cisteina tirosina, serina, glutammina formano complessi reattivi che possono combinarsi tra loro formando ponti di metilene (cross-link) o con gruppi idrogeno.

H₂O corrente (del rubinetto, ad esempio, essendo pieno di cariche quindi di ioni calcio, essi si vanno a legare ai ponti disolfuro non legati ancora bene, gli ioni si portano via questi ponti → evita iperfissazione perché vengono tolti residui di formalina) può revertire la formazione di alcuni ponti.

Pericoli associati a uso della formaldeide, irritante, corrosiva, può causare sensibilizzazione allergica; è stata elencata come "cancerogena per l'uomo" → cancro nasofaringeo, cancro sinonasale e leucemia mieloide.

Glutaraldeide, fissativo più forte, forma legami più forti e più rapidamente ma più lenta a penetrare nel tessuto, perciò usata formalina.

Fissativi mercuriali, in generale poco o niente usati → non usato oggi.

Alcol (metanolo o etanolo) usato per disidratare (togliere acqua) tessuto e inducono indurimento; per passare da un liquido ad un altro devo utilizzare intermedi a concentrazioni scalari.

Diafanizzazione da alcol a paraffina, utilizzo xiloro, tanto solubile in H₂O che in paraffina, poi campione posso metterlo in paraffina.

Alcol denatura proteine, fa perdere funzione enzimi litici, ottimo fissativo (per la citologia) ma questa coagulazione delle proteine (denaturate) mi rovina la morfologia.

Esame estemporaneo e crio-preservazione

Esame estemporaneo: su campioni freschi inviati al lab durante un'operazione chirurgica, risultato entro 15 minuti → problema, perdiamo morfologia e si formano i cristalli ed esplodono le cellule perché l'acqua quando ghiaccia si espande quindi utilizzo azoto liquido a temperature molto basse + isopropanolo per non far bruciare il tessuto (congelamento a -80) → si taglia con criostato a -20°C.

Cryo-preservazione quasi esclusivamente per esami intra-operatori (per colorazione e studio attività dei lipidi che sono solubili in alcol 100% che quindi li scioglie, anche la paraffina li scioglie, perciò è più comodo studiarli in questo modo); è veloce e non altera struttura proteica ma è tecnicamente complesso e ha una conservazione limitata nel tempo.

*4% di formaldeide nella soluzione al 10% del laboratorio, inoltre in questa soluzione c’è tampone per mantenere pH soluzione (perché la soluzione con formalina tende a diventare acida).

Formalina: formazione reticolato proteico catalizzando ponti metilenici tra amminoacidi presenti nelle proteine (sia all’interno della stessa proteina, sia tra le proteine vicine della cellula come il citoscheletro) → reazione “reversibile” per i legami: blocco legame parziale → rompo, per revertire legame non è una vera reazione di reversione perché rompo legami parziali → legami metilenici chiamati cross-link.

Il lavaggio con acqua corrente serve per la parte superficiale che può risultare iperfissata e i legami sono più deboli, quindi per non coprire troppo gli antigeni si esegue il lavaggio.

In chirurgia, durante un’operazione invece di utilizzare barattoli di formalina che possono risultare tossici, il frammento del campione viene messo in un sacchetto sottovuoto, mantenuto in frigo e poi mandato in anatomia patologica per lavorazione con formalina.

Fase macroscopica e processazione del tessuto

Flusso di lavoro: fase macroscopica → descrive macroscopica campione.

Fase di riduzione o prelievo → prelievo della parte di interesse di lesioni ecc, tagli devono entrare nelle biocassette.

Fissazione può avvenire prima (processazione diretta) del prelievo o dopo (va messo in formalina).

Processazione del tessuto: aumentare resistenza al taglio per permettere di tagliare sezioni sottili.

Campione in formalina, lavo con acqua corrente per iperfissazione e devo processare campione.

Disidratazione: alcol toglie acqua per prenderne il posto all’interno delle cellule (alcol e acqua sono solubili quindi è facile prenderne il posto), ma alcol non è solubile in paraffina, quindi, ha bisogno di un mezzo che sia solubile sia in alcol che in paraffina: xilene.

Chiarificazione: xilene dissolve l’alcol; passaggio tra alcol e paraffina ma dato che alcol non è solubile in paraffina uso xilene che è solubile in entrambe (xilene è estremamente tossico, si usano altri solubili come il noxi, non tossico).

Inclusione: paraffina, prende il posto dello xilene; paraffina è la cera delle candele, più pura al 100%. Ha come temperatura di fusione 55/60°C, liquida poco viscosa e solidifica tutto il tessuto insieme perché è stato trattato.

Procedimento di inclusione

Procedimento: prendo i campioni, non tanti, si mettono su piastra dell’inclusore, piastra calda (per mantenere paraffina liquida), apro la cassettina mettendo la parte del numero verso l’inclusore (perché coperchio può saltar via e cadere a terra o addosso img2), si sceglie la formella (in acciaio) idonea al campione della biocassetta (img3), poi mi metto al centro in uno spazio dove è refrigerato (quando si va a tagliare al microtomo, per formazione vetrino, comincio a tagliare da sotto il blocchetto, quindi quando devo includere il campione devo cercare di spingerlo il più possibile verso il fondo, in modo da facilitare sgrossamento img3 spingo campione). In questo spazio refrigerato dopo aver spinto campione, lo includo in paraffina che solidifica subito, metto coperchio e riaggiungo paraffina liquida (perché paraffina quando solidifica si restringe e quindi fare ulteriore strato sopra) metto formella nella piastra refrigerata.

Infine, paraffina ben solidificata, si stacca campione da formella in acciaio ed è pronta per taglio e sgrossamento.

Nei processatori, ci sono i primi due passaggi per la formalina ma non vengono usati per problemi di sicurezza, perché non lavoro sotto cappa ed è pericoloso mettere formalina nelle taniche quindi faccio solo altri passaggi; formalina fatta prima sotto cappa.

Procedimento: 1,2 (formalina che non si fa), 3,4,5,6,7,8 (alcol 80%, 95%, 95%, 100%, 100%, 100%), 9,10 (xylene 100%, 100%), 11, 12, 13, 14 (paraffina).

Taglio

Il taglio: vengono usati due tipi di microtomi, rotativo e a slitta; cambia se si muove il campione o la lama.

Rotativo si muove il campione / a slitta il campione sta fermo e si muove la lama.

In questa sezione ci sono:

• Piastra refrigerante 20°C.
• Bagnetto caldo.
• Vaschetta acqua fredda.

Taglio prevede due fasi: sgrossamento, in cui si toglie la paraffina per arrivare al campione, con spessore più elevato come 10 micron, finché non si arriva sul campione → taglio 3/4 micron che è il taglio standard che si fa per campione.

*Ritaglio: quando viene richiesto il taglio di un campione per ulteriori accertamenti, campione già sgrassato ma ogni volta che taglio cambia sempre un po’ l’inclinazione; quindi, bisogna allineare in base al campione.

Dopo il taglio di campione → acqua fredda mi consente di aprire la sezione soprattutto se è arrotolata e si possono eliminare pieghe presenti nelle sezioni, grazie ad un pennello e un vetrino che poi si ristacca e mano a mano la si tira senza rovinarla.

Faccio aderire sezione sul vetrino per capillarità e sposto il vetrino con campione in acqua calda da cui la sezione si stacca dal vetrino, a 38/40°C la paraffina si allarga quindi si allarga la sezione che galleggia in questo bagnetto.

Vetrini utilizzati:

• Carica positiva, trattengono più forte sezione su vetrino e lo uso quando mi serve una particolare tecnica su quella sezione, come ad esempio l’immunoistochimica (la sezione così non si stacca).
• Vetrino normale, non carico, per colorazioni semplici basta questo vetrino ma si può usare anche quello a carica positiva (che costa di più quindi non conviene).

Ottenuto il vetrino con la sezione metto il vetrino in stufa a 60°C per 20 min, un po’ di paraffina in eccesso si toglie ma lo faccio per far aderire bene la sezione al vetrino (quando raccolgo vetrino rimane un po’ di acqua che in questo modo faccio evaporare) ma perché faccio questo passaggio? Perché poi il vetrino torna in xilene e in questo modo la sezione si staccherebbe dal vetrino (perché acqua si impasterebbe con xilene).

Arrivati alla paraffina, tutte le metodiche che si fanno dopo (ibridazioni in situ, colorazioni, ecc) le faccio tutte con solventi acquosi e quindi devo rifare la scala al contrario con il vetrino questa volta (xylene, alcol, acqua) → si toglie paraffina e si reintroduce l’acqua.

Ematossilina & eosina

Colorazione base, la più utilizzata per fare diagnosi microscopica.

Ematossilina colorante basico, che colora molecole acide di blu (acidi nucleici) → acidofilo.

Eosina colorante acido, che colora molecole basiche di arancio/rosso (citoplasma e proteine) → basofilo.

Risultato: nuclei blu e citoplasma rosa/arancio.

Un colorante è specifico, l’ematossilina (legame molto forte, non lo tolgo con niente) viene fatto prima quindi per circa 4 minuti; mentre l’eosina è aspecifico quindi colora tutto dopo.

Per questo faccio prima quello specifico senno quello aspecifico mi colora tutto.

Lavo in acqua corrente almeno il doppio del tempo della prima colorazione (se ematossilina 4 min lavo in acqua per 8 min) perché l’acqua corrente carica di ioni che tolgono ematossilina che ha legato in modo aspecifico quindi legami non saldi, tolgo residui → differenziazione.

*Non in tutti i posti l’acqua è piena di ioni quindi in questi casi si usa acido cloridrico in acqua per caricare l’acqua.

Poi si colora con eosina (aspecifico, che colora tutto in rapporto alla densità del campione) dove ci sono organelli più scuri, dove ci sarà solo citoplasma saranno più chiari.

Faccio le metodiche che mi servono (es. immunoistochimica) e volendo posso rendere il campione permanente, facendo nuovamente una processazione da acqua a xylene:

• Rendere permanente un vetrino: mentre l’ematossilina non si toglie, l’eosina è solubile in acqua quindi i lavaggi (processazione da acqua in alcol devono essere molto veloci altrimenti si portano via tutta l’eosina, gli altri più lenti). Torno quindi allo xilene e faccio questo processo al contrario per montare un vetrino (per mettere resina solubile in xilene sul vetrino, questa resina attacca copri oggetto al vetrino e soluzione colorata si può preservare anche per 15/20 anni).

Lezione 3 – Immunoistochimica

Tecnica per rilevare presenza di specifici marcatori proteici che possono classificare e stadiare i tumori.

Vengono utilizzati anticorpi:

• Policlonali, riconoscono diversi epitopi di una proteina.
• Monoclonali riconosce solo un epitopo (si evita errore perché il policlonale può selezionare epitopo che non fa parte della proteina di interesse).

Fissazione: impedire degradazione degli antigeni (del tessuto), mantiene la loro distribuzione spaziale, formalina può mascherarmi questi ant