Genetica molecolare

Genetica molecolare

Lezione 04.03.21

Penetranza legata all’età: es. malattia di Huntington, che ha una mutazione nel gene che codifica per una prolina all’interno del gene Huntingtina, in cui c’è il fenomeno di anticipazione (malattia neurodegenerativa fatale). Si è però visto che, nel caso di appaiamento sfalsato, in seguito a ricombinazione (da un lato aumentano i codoni e dall’altro diminuiscono) la malattia è più aggressiva = anticipazione del fenotipo nelle progenie successive (es. genitori che manifestano a 50 anni, avranno i figli che, se hanno l’allele ricombinato sfalsato con aumento del numero di codoni, manifestano prima e in maniera più aggressiva).

Inbreeding: quando si viene a generare una progenie da due individui consanguinei, perché si hanno gli alleli nella stessa posizione e la possibilità di avere delle malattie autosomiche recessive è molto ampia.

Mappa genetica = fornisce un’idea della disposizione dei geni ma non delle reali distanze tra i geni (mappa fisica del genoma).

Dominanza per aploinsufficienza

Dominanza per aploinsufficienza → es. Arabidopsis Thaliana con due mutazioni che cadono nello stesso locus sugli alleli ref4-4 e ref 4-3.

Entrambe le piantine non wildtype sono in condizioni di eterozigosità, ed entrambe le mutazioni generano una loss of function.

La mutazione ref4-4 genera un fenotipo molto simile a quello wildtype, perché l’allele non mutato è in grado di sopperire alla perdita, mentre ref4-3 ha una notevole differenza.

In ref4-4 ho una mutazione puntiforme che non altera completamente la funzione del gene, mentre in ref4-3 ho una mutazione più estesa che comporta un allele nullo, il fenomeno è dominante perché la quantità di enzima prodotta dall’allele wild type non è sufficiente a superare la soglia per determinare un fenotipo normale = aploinsufficienza.

Per dimostrare che si tratti effettivamente di un fenomeno di aploinsufficienza, possiamo andare a sovra produrre il prodotto del gene non mutato (con dCas9) e ristabilire la condizione wildtype, bilanciando la perdita di prodotto generata dall’allele che ha perso la funzione → si ottiene di nuovo un fenotipo dominante.

Dominante negativo

Dominante negativo → è una loss/gain of function (è un mix) perché il dominante negativo è un allele che va ad interferire con la funzione di quello selvatico.

Es. recettore di membrana che dimerizza a seguito del legame con un legame specifico (es. recettore tirosin-chinasico). Nello specifico ho una omodimerizzazione.

Posso avere uno dei due domini che è mutato (eterozigosità con una loss of function) avrò un fenotipo dominante negativo perché la coppia mutato-wt non genera un recettore funzionante, ma solo la coppia wt-wt è funzionale.

Avrò quindi il 75% di attività nulla e solo il 25% funzionante. È infatti necessario che entrambi i domini riescano a riconoscere il ligando per avere un prodotto finale > del 50%.

N.B. Se ho un fenotipo di dominanza negativa (causato da una loss of function) e ho dimostrato che non è un problema di aploinsufficienza, senza conoscere né il prodotto né l’ambiente in cui lavora, posso stabilire a priori che il mio gene produce un fattore che è organizzato in dimeri.

Un altro fenomeno molto importante è la non complementazione del secondo sito.

Reminder → il test di complementazione permette di capire se due mutazioni sono sullo stesso gene o su geni diversi, incrociando un eterozigote con un omozigote recessivo ←.

Eterozigote composto: combinazione di due alleli non funzionali che danno un fenotipo diverso da quello selvatico.

Non complementazione del secondo sito → se dovessi avere il caso in cui due mutazioni che non sono sullo stesso gene, forniscono ugualmente il fenotipo recessivo (es. occhi bianchi in Drosophila).

Esempio di non complementazione del secondo sito

Esempio:

Ho una via metabolica che ha come obiettivo quello di formare il pigmento rosso, quindi se per omozigosi perdo uno degli enzimi intermedi, avrò il colore bianco.

(bianco) A (w1) B (w2) C (rosso) [w1 e w2 sono gli enzimi]

• Se ho un caso di omozigosi in w1 lo 0% di A verrà trasformato in pigmento rosso.
• Se ho un caso di omozigosi in w2 il 100% di A verrà trasformato in B ma poi lo 0% sarà trasformato in C quindi tutto il prodotto sarà bianco.

Perché però anche l’eterozigote w1-w2 darà un prodotto bianco?

Ris → Nella prima condizione di eterozigosità avrò il 50% percento di enzima w1, quindi solo il 50% di A diventerà B, e poi il 100% di B sarà trasformato in C (tot. 50% iniziale = l’eterozigote singolo è rosso).

Nella seconda condizione di eterozigosità avrò il 50% percento di enzima w2, il 100% di A verrà trasformato in B e poi il 50% sarà trasformato in C (tot. 50% iniziale = l’eterozigote singolo è rosso).

Nel caso della doppia eterozigosità w1-w2 mutati, avrò il 50% di A che viene trasformato in B e un ulteriore 50% di B che viene trasformato in C (tot. 25% iniziale, che non è sufficiente = il doppio eterozigote è bianco perché la quantità di C prodotta insufficiente a generare il prodotto rosso).

N.B considera che non è detto che la quantità di prodotto minimo sia 50%, ci possono anche essere eterozigoti composti con una funzione minima del 20%.

La non complementazione del secondo sito permette di ipotizzare che due geni abbiano un’interazione tra di loro, ovvero che i loro prodotti siano nello stesso ambito funzionale.

Variazione da effetto di posizione

Un fenomeno epigenetico è la variazione da effetto di posizione = diversità a livello del colore dell’occhio di Drosophila (ha un occhio composto, cioè formato da circa 800 ommatidi - ogni ommatidio lavora come un pixel - che formano il macchinario visivo).

Reminder → in passato per produrre i mutanti in Drosophila venivano usati degli agenti fisici, come ad esempio i raggi X e in particolare venivano mutagenizzati i maschi, per generare delle alterazioni cromosomiche che sarebbero state poi evidenziate a seguito di incroci ←.

Avevano quindi trovato un esemplare di D. con un occhio variegato (N.B. la disposizione cromatica degli ommatidi è completamente casuale quindi, un individuo della progenie di D. con occhio variegato, avrà delle sfumature di colore disposte diversamente), avente alcuni ommatidi con 100% rosso, altri 100% bianchi e altri con delle sfumature intermedie.

A che cosa è dovuto però questo fenomeno? È determinato da un’inversione che coinvolge anche una funzione del centromero.

Le regioni centromeriche sono formate da eterocromatina, in cui la capacità trascrizionale è silenziata, e addirittura, in alcuni casi, i geni in prossimità della regione centromerica eterocromatica possono inattivarsi a seguito di un’espansione della eterocromatina.

L’eterocromatina del centromero è molto importante anche ai fini della segregazione, ma è necessario che ad un certo punto si arresti, per disporsi come eucromatina (più distesa e disponibile all’attacco della RNApol) al fine di far esprimere il gene.

Esiste, per questo, un elemento di controllo che impedisce alla cromatina centromerica di espandersi.

Ma, quando avviene l’inversione in cis, potrebbe succedere che la zona di “scambio” comprenda anche il gene white che, come si vede dall’immagine, è ora portato in prossimità dell’eterocromatina centromerica e venga perso anche l’elemento di controllo dell’espansione dell’eterocromatina. La perdita di questo elemento permette alla cromatina, in maniera del tutto casuale di espandersi o meno, e quindi potremmo avere:

• Il caso in cui l’eterocromatina si espande fino a raggiungere w+ → l’ommatidio sarà di colore bianco.
• Il caso in cui l’eterocromatina non si espande e w+ non viene silenziato → l’ommatidio sarà rosso.
• Il caso in cui la cromatina è più o meno vicina a w+ avremo le intensità di colori intermedie e il gene sarà più o meno espresso.

Possiamo considerare l’effetto della variegazione come una forma di mosaicismo?

Ris → il mosaicismo viene definito principalmente per due cellule geneticamente diverse e/o nel caso del cromosoma X. In questo caso nessuno dei due casi si manifesta perché le cellule sono tutte identiche tra loro (sono tutte parte dello stesso occhio) ed essendo un individuo maschio non abbiamo l’inattivazione di uno dei due cromosomi X. Cambia solamente la disposizione dei geni sul cromosoma in cui è avvenuta l’inversione.

Nel caso descritto sopra abbiamo una prima mutazione (= inversione) che genera un individuo con variegazione dell’occhio. A seguito di questa prima mutazione potremmo avere altre mutazioni (su altri geni posti su altri cromosomi) che possono, o lasciare la situazione immutata, oppure interagire come mutanti sull’effetto della prima mutazione:

• Su(var) = soppressione della variegazione. Una seconda mutazione su un altro cromosoma ha soppresso (non totalmente) l’effetto del position-effect variegation. N.B non è una reversione perché non abbiamo ripristinato l’inversione.
• E(var) = potenziamento della variegazione. Una seconda mutazione (sempre su un locus differente) va ad aumentare la manifestazione della prima.

Nei casi di suppressors ed enhancers, posso stabilire quali altri geni, fisiologicamente, vanno ad influire sulla manifestazione del gene di mio interesse.

Ad esempio, per il caso 1 potrei avere una seconda mutazione su un gene che codifica per un prodotto che permette alla cromatina di espandersi, rendendolo silenziato. Se questo prodotto manca, la cromatina rimane immobile e il gene w+ non viene silenziato → l’occhio sarà principalmente rosso.

Per il caso 2 potrei invece avere una seconda mutazione, sempre sul gene che codifica per il prodotto che permette alla cromatina di espandersi, rendendolo sempre attivo. Se questo prodotto viene sovraespresso, la cromatina sarà sempre spinta ad espandersi e il gene w+ sarà sempre silenziato → l’occhio sarà principalmente bianco.

N.B. il meccanismo di soppressione e di enhancement sono meccanismi allele specifici, perché se nel gene Suv produco una mutazione, su 10 alleli diversi, non è detto che tutte le mutazione siano soppressorie.

Enhancement sintetico e letalità sintetica

Enhancement sintetico → si manifesta quando vengono considerate due mutazioni, che prese singolarmente non alterano il fenotipo, e che messe insieme generano un fenotipo recessivo.

Nell’immagine si può vedere come le mutazioni anp2/anp3/mpk4 se prese singolarmente danno un fenotipo pressoché normale, mentre invece combinate in anp2-mpk4 e anp3-mpk4 influenzano di molto la crescita delle radici.

Si parla quindi di enhancement sintetico se una delle due mutazioni (in questo caso mpk4) è in grado di enfatizzare l’effetto dell’altra.

Un’estremizzazione dell’enhancement sintetico è la letalità sintetica → due mutazioni differenti, che separatamente generano un individuo wildtype, se combinate, sono letali. Il doppio mutante non è vitale.

Esempio → “Zebrafish” in letalità sintetica legata alla combinazione di particolari molecole.

Il mutante fancd2 (mutante in un gene di riparazione del DNA) è sostanzialmente wt.

Il mutante con un inibitore di Chk1 (di un check-point del ciclo cellulare) è praticamente wt.

Se però prendo un mutante di fancd2 e inserisco l’inibitore Chk1 avrò delle larve tutte morte, cioè la combinazione delle due mutazioni sono letali.

Questo fenomeno di letalità sintetica viene usato oggi nella ricerca per il cancro, al fine di generare delle combinazioni che sono letali per le cellule tumorali e che le inducono a morte spontanea. (Si cercano dei farmaci in grado di fare ciò).

Genetica classica e genetica molecolare

Genetica classica: processo biologico → identificazione mutanti → trovare il gene → funzione biochimica.

Nel caso di Morgan che vuole occuparsi della formazione dell’occhio in D. avrò:

Formazione dell’occhio → mutante occhio white → locus di w+ → funzione del gene w+.

Ad oggi sappiamo che w+ è un trasportatore ATP-binding del tipo efflux (trasporto verso l’esterno), che appartiene ad una famiglia molto grande di trasportatori (nell’uomo ce ne sono 48) e che uno di questi trasportatori è l’ortologo del gene w+ chiamato ABCG2 (nell’uomo è specifico per la detossificazione, ed è sovraespresso nelle cellule tumorali, specialmente in quelle nel cancro al seno = motivo per cui alcuni tipi di tumori sono resistenti ai farmaci chemioterapici, ABCG2 rigetta fuori il farmaco).

Vs

Genetica molecolare (deve sempre tener conto di quella classica): gene clonato a funzione ignota → generazione di mutanti → fenotipo mutante (?) → funzione.

Avrò ad esempio un gene di cui non conosco la funzione (ad esempio w+) e per identificarla inizio a generare diversi mutanti e ad osservarne il fenotipo (ad esempio mutanti white hanno occhi bianchi). A questo punto posso fare delle ipotesi sul ruolo del gene in questione.

Differenze tra DNA ed RNA

Qual è la differenza tra DNA ed RNA?

• Nel DNA abbiamo il deossiribosio e nell’RNA abbiamo il ribosio.
• Nel DNA troviamo la timina, nell’RNA troviamo l’uracile.
• Il DNA contiene tutta l’informazione genetica, mentre l’RNA è molto instabile ed è funzionale ai fini di trascrizione e traduzione (funzione di trasporto).

Esistono però alcuni particolare RNA che hanno anche attività catalitica e inoltre, è possibile isolare in vitro degli RNA che hanno delle strutture terziarie particolari, in grado di svolgere attività enzimatiche → si pensa quindi che inizialmente il mondo era ad RNA.

Perché allora ad un certo punto l’RNA viene rimpiazzato dal DNA?

Ris → Perché è necessario mantenere l’informazione stabile il più a lungo possibile e ciò può essere fatto grazie alla presenza del desossiribosio che, grazie all’assenza di un gruppo -OH sul C2, non può effettuare un attacco nucleofilo sul fosfato, andando a rompere la catena per idrolisi.

Di conseguenza è invece importante che l’RNA possa essere velocemente degradato, proprio per il suo ruolo di messaggero temporaneo, cioè una volta svolto il suo compito è bene che sia eliminato per lasciare spazio agli altri: ciò avviene grazie alla presenza, nella sua catena, del ribosio.

Come si può spiegare la differenza di basi tra DNA ed RNA (U/T)?

Ris → nelle cellule la reazione di degradazione dell’RNA avviene grazie alle RNAsi, che inizialmente non erano estremamente competenti e nelle cellule batteriche sia DNA che RNA erano nel citosol (no nucleo). Per questi motivi era necessario trovare un modo per poter marcare differentemente l’RNA, che doveva essere eliminato, dal DNA: venne introdotto l’Uracile, che era il marker bersaglio delle RNasi. Quando si ha una deamminazione della citosina, si ottiene una citosina con gruppo chetonico, ovvero un Uracile e, non a caso, gli enzimi più abbondanti in natura sono le Uracil-DNA-glicosilasi (enzimi di riparazione del DNA che riconoscono la presenza dell’Uracile come un’anomalia e lo rimuovono, generando un sito a-pirimidinico, in cui successivamente una DNApol e una ligasi inseriscono una citosina per riparare il gap).

Lezione 08.03.21

Le mutazioni che vengono effettuate durante la genetica inversa sono sito specifiche, ad esempio per il cromosoma, ma per la posizione effettiva sono casuali.

Il gene più grande presente nel nostro genoma è quello della distrofina (2,2 Mbasi) e le mutazioni su questo gene causano la Distrofia Muscolare di Duchenne.

Le RNasi velocizzano a pH neutro l’eliminazione dell’H in C2 al fine di facilitare l’attacco dell’O- sul fosforo, per degradare gli RNA sia a singolo filamento che a doppio filamento.

N.B. gli RNA non sono mai totalmente a singolo filamento ma sono spesso presenti degli appaiamenti intracatena che generano delle strutture secondarie tipiche, come ad esempio la forcina, che possono dare particolari strutture terziarie dotate di attività catalitica.

Recentemente si è scoperto che la macchina proteica dello spliceosoma (ribonucleoproteina) vede la sua attività catalitica nella parte di RNA presente.

Perché un ambiente basico porta alla denaturazione del DNA?

Ris → la teoria di appaiamento delle basi è valida solamente a pH neutro, poiché a variazioni di pH seguono delle tautomerie chetoenoliche (G/T) o ammino-imminiche (A/C) che vanno a modificare la struttura delle basi che non sono più in grado di effettuare gli appaiamenti canonici (A-T e G-C).

Nell’immagine a sinistra ho le molecole a pH neutro e a destra quelle a seguito di variazioni del pH.

Nel caso dell’adenina e citosina ho la perdita di un H e quindi perdo la possibilità di creare un ponte idrogeno.

Per guanina e timina a pH neutro ho la presenza del gruppo chetonico che è un accettore di H in grado di generare ponti idrogeno, ma a seguito di una variazione del pH l’ossigeno del gruppo chetonico effettua un legame stabile con un H e quindi non è più disponibile per fare un legame ad idrogeno.

Tutte queste variazioni avvengono a pH basico e, se inserite nel DNA, ne causano la denaturazione perché non è più possibile effettuare i legami ad idrogeno che tengono uniti i due filamenti.

Perché gli appaiamenti canonici tra basi sono gli unici possibili?

Ris → perché sono gli unici compa