Genetica Molecolare

Genetica molecolare

Revisione dei concetti

Complicazioni dei pattern mendeliani

Penetranza legata all’età

Questo fenomeno comporta la comparsa di manifestazioni fenotipiche che dipendono dall’avanzamento dell’età e non avvengono in tutti gli individui. Difatti, esistono patologie per cui è possibile osservare che individui portatori della stessa lesione genetica possono anche non manifestare il fenotipo o manifestarlo tardivamente.

Un esempio di penetranza legata all’età è una mutazione in p53; p53 è chiamato il “guardiano del genoma” poiché è un importante e complicato fattore di trascrizione, è un sensore del danno che può attivare geni coinvolti nella riparazione del DNA e può interrompere il ciclo cellulare in presenza di errori, impedendo di proseguire nella fase S, per evitare che la cellula si duplichi con possibili danni o alterazioni del genoma. Quando il DNA riacquista integrità, anche se il danno non è stato riparato esattamente, p53 lascia che la cellula prosegua nel ciclo. p53 è uno dei primi oncosoppressori identificati, perciò se è assente o mutato la cellula può dividersi anche se il DNA non è perfettamente riparato, ottenendo cellule figlie con genoma danneggiato e non integro e che possono continuare ad accumulare errori perché anche in esse p53 non è espresso. Le mutazioni in p53 possono verificarsi sia nella linea germinale che in cellule somatiche.

Nel primo caso si può verificare ad esempio la sindrome di Li-Fraumeni, una patologia che causa cancri multipli; in ogni caso p53 mutato, in singola ma soprattutto in doppia copia, può comportare la formazione di tumori. È un esempio di penetranza legata all’età perché la presenza di p53 mutato predispone allo sviluppo di tumori, ma non necessariamente conduce alla loro comparsa, la quale diventa più probabile con l’avanzare dell’età. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che il microambiente può condizionare in modo significativo lo sviluppo di un tumore anche in presenza di un’importante lesione come quella in p53.

Letalità legata all’Y

Questo fenomeno si manifesta solitamente in casi di dominanza per aplo-insufficienza, in cui gli individui femminili eterozigoti di solito presentano un fenotipo alterato ma sono vitali, invece nei maschi la mutazione provoca la morte degli individui. Ciò può verificarsi per la presenza della mutazione sul cromosoma X, e di conseguenza i maschi con la mutazione sono emizigoti e muoiono, oppure su un cromosoma autosomico ma in un gene che regola geni dell’Y. Perciò, nelle femmine questi geni hanno altre funzioni e non creano particolari problemi, mentre negli uomini possono provocare un’alterata segregazione dell’Y o altre problematiche che comportano come fenotipo la letalità.

Questo dimostra che non sempre le mutazioni che portano letalità sono dovute a questioni metaboliche, ma anche alla meccanica del sistema, poiché i cromosomi sessuali hanno meccanismi particolari di segregazione e se viene alterato qualche elemento importante coinvolto in essa si ottengono cellule che perdono uno dei due cromosomi, che quindi probabilmente muoiono, e di conseguenza possono portare a un individuo non funzionale.

Mosaicismo

Un esempio di mosaicismo funzionale è l’inattivazione del cromosoma X negli individui femminili dei mammiferi, visibile fenotipicamente, ad esempio, nel colore del pelo del gatto calico o tartarugato femmina, con porzioni arancioni, nere e bianche (anche se queste ultime sono dovute a epistasi). Allo stesso modo, in tutte le femmine dei mammiferi, se si analizzano diverse cellule, si osserva che in esse non è stato inattivato sempre lo stesso X. In caso di geni che sono coinvolti, per esempio, nel controllo della pigmentazione, nelle femmine si osserveranno aree del corpo più pigmentate e altre meno.

Se in uno dei due cromosomi X è presente una mutazione in un gene fondamentale per la sopravvivenza, allora le cellule che inattivano il selvatico muoiono, mentre quelle che inattivano il mutato non soccombono e sopravvivono. In questo caso non vi è una distribuzione random dell’inattivazione tra X materno e paterno, ma vi è uno spostamento dell’inattivazione, chiamato skewing, verso uno dei due X, perché tutte le cellule che sopravvivono avranno inattivato l’X mutato.

Il mosaicismo si può sviluppare anche per cambio genetico di una cellula nelle prime fasi dello sviluppo, o per fusione di due zigoti differenti che danno luogo a un unico embrione, che è il mix dei due zigoti originali; questi casi si riscontrano per geni sui cromosomi autosomici.

Un altro meccanismo legato alla notevole plasticità dell’embrione nelle primissime fasi dello sviluppo è la risoluzione di situazioni di aneuploidie dovute a non disgiunzione dei cromatidi fratelli nella meiosi, ad esempio nel caso della trisomia 21. Questa sindrome si verifica mediamente con una frequenza di 1 su 500-600 nati, ma aumenta la probabilità all’aumentare dell’età della madre, infatti a 45 anni la probabilità è di 1 su 20. Tramite analisi tissutale di individui fenotipicamente sani è stato scoperto che l’incidenza in realtà è maggiore ma in diversi casi viene risolta allo stadio embrionale, poiché a causa di problemi di segregazione nello zigote si formano cellule normalmente diploidi, le quali prendono il sopravvento sulle cellule trisomiche, di conseguenza esistono individui fenotipicamente sani che però hanno una bassa percentuale di cellule che presentano trisomia 21.

Un altro esempio è legato all’anomalia del cromosoma circolare, ossia un cromosoma che durante la ricombinazione ha perso i telomeri creando una struttura circolare, che si mantiene nelle cellule figlie perché grazie alla presenza del centromero può segregare correttamente; la presenza di questi cromosomi circolari in alcune cellule di un individuo è legata allo sviluppo di lipomi, ossia tumori della cellula adiposa.

Mappe del genoma

Una mappa genetica stabilisce la posizione e l’ordine dei geni sui cromosomi, e la prima è stata fatta da Morgan con il gene per il colore degli occhi di Drosophila, collocandola sul cromosoma X, unendo così le osservazioni sulle strutture che si notavano durante la divisione cellulare, ossia i cromosomi, con il fatto che queste sono le portatrici dell’informazione genica. Grazie ai suoi allievi (Bridges e Sturtevant) riuscì a definire che in Drosophila esistono 4 cromosomi, ciascuno con dei marcatori in posizioni precise.

La mappa fisica per eccellenza, per qualunque genoma, è la sequenza intera; nella cellula umana aploide il numero di basi conosciuto fino ad ora è 3,9 miliardi, in particolare negli ultimi mesi questo numero è aumentato poiché è stato possibile sequenziare anche la regione dei centromeri, considerata non sequenziabile fino a poco tempo fa, e costituita da circa 700 milioni di paia di basi, corrispondenti circa al 20-25% di basi in più. È rilevante anche per la quantità di DNA contenuto nella cellula umana, che si credeva fosse intorno ai 6 pg ed è aumentato a 7-8 pg.

Questo è stato possibile solo ora perché le tecniche precedenti di sequenziamento non permettevano di leggere lunghe sequenze ripetute, il cui ordine non era conosciuto; tramite le nuove tecniche non ci si basa più sul sequenziamento Sanger, ma si utilizza il nanoporo, che sfruttando la differenza di potenziale permette il sequenziamento di molecole quasi naturali, perciò si possono leggere consecutivamente anche frammenti da un milione di basi. Invece le tecniche da Sanger in poi si basano sulla riduzione del DNA in numerosi frammenti e la successiva rielaborazione dal punto di vista bioinformatico; anche in questa tecnica vi è la rielaborazione bioinformatica ma utilizzando frammenti di grandi dimensioni.

Al momento non è la tecnica ideale, ma è importante perché ha permesso di risolvere uno dei quesiti principali sull’organizzazione del DNA a carico dei genomi dei mammiferi. Ma ciò vale anche per organismi come Schizosaccharomyces pombe, un lievito che opera la divisione cellulare in maniera simile alle cellule umane, in cui la sequenza centromerica è costituita da sequenze ripetute. Nei diversi organismi le sequenze sono diverse ma seguono lo stesso concetto, anche se negli esperimenti la particolarità delle sequenze risulta inutile per la divisione. Questa tecnica ha permesso di comprendere l’organizzazione delle regioni centromeriche, costituite dalla ripetizione di brevi sequenze da 171-174 bp numerose volte, fino a costituire regioni da qualche milione di basi.

La mappa genetica è un approccio concettuale importante, si costruisce senza conoscere il DNA, infatti ad oggi non si utilizzano più, anche perché è diventato più facile sequenziare e confrontare un genoma mutato e uno selvatico. Però le mappe genetiche sono state importanti per anticipare l’ordine dei geni di 50-70 anni rispetto alla mappa fisica.

Casi particolari di dominanza e recessività

Un allele dominante è quello di cui viene espresso il fenotipo in un individuo eterozigote, e normalmente la dominanza è legata a un’acquisizione di funzione, salvo eccezioni come casi di dominanza apparente dovuta a perdita di funzione. Con acquisizione di funzione non si intende la comparsa di una funzione nuova, ma diversa, ad esempio nel cancro vi può essere un recettore di membrana che per attivarsi necessita di un ligando, ma se il recettore perde il dominio di interazione col ligando e si attiva in maniera costitutiva si ottiene un’acquisizione di funzione, poiché si passa da una situazione di controllo all’attivazione di una funzione sempre presente, indipendentemente dal ligando. Il fenotipo dell’allele recessivo, invece, solitamente si manifesta solo in caso di omozigosi.

Tuttavia, esistono delle situazioni in cui i rapporti tra gli alleli sono alterati; ad esempio, la codominanza, che è il manifestarsi di due alleli che si co-esprimono allo stesso tempo nell’eterozigote, non essendo perciò né dominanti né recessivi. Altri esempi sono l’aplo-insufficienza, la dominanza negativa e la non complementazione del secondo sito.

L’aploinsufficienza è un caso di loss of function che, però, causa la dominanza dell’allele mutato. Un esempio è osservabile in Arabidopsis thaliana, in cui la presenza in eterozigosi di un allele produce un fenotipo indistinguibile dal wild-type, mentre in eterozigosi per un altro allele si produce un fenotipo notevolmente diverso per via di una insufficiente produzione di sinapoilmalato. Questo è un esempio di aplo-insufficienza, in cui la presenza di un solo allele wild-type non è in grado di compensare secondo il principio della complementazione.

Un altro fenomeno che può causare aploinsufficienza è la presenza di una mutazione che blocca la produzione del prodotto del gene da una delle due copie per via del NMD (Non Mediated Decay), che si verifica quando vi è una mutazione di tipo frameshift (per inserzione o delezione di basi in numero non multiplo di 3) che produrrebbe un messaggero non funzionale; questo messaggero viene riconosciuto dai meccanismi di sorveglianza all’interno del nucleo, tali per cui non viene spesa energia per farlo fuoriuscire dal nucleo e tradurlo visto che non si otterrebbe un prodotto funzionale; il trascritto errato viene riconosciuto grazie alla presenza di codoni di stop precoci causati dal frameshift, che vengono riconosciuti dal precursore del ribosoma.

Nell’esempio sottostante, l’animale in alto è wildtype e sano, quello al centro manifesta il fenomeno dell’aploinsufficienza, ad esempio per il fenomeno appena descritto, e infine l’animale in basso riacquista il fenotipo wildtype grazie all’utilizzo della CRISPR-Cas9 con una finalità diversa dal solito, ossia che non taglia ma che è in grado di posizionarsi correttamente sulla copia wildtype, poiché pur essendo in forma inattiva è capace di riconoscere la sequenza a cui legarsi, come ad esempio quella di un promotore, e possiede anche un dominio di attivazione, il quale consente di avere una sorta di nuovo fattore di trascrizione che permette di produrre il doppio della quantità di prodotto da una singola copia, e che perciò causa il recupero del fenotipo wildtype, dato che l’alterazione del fenotipo dipendeva dal dosaggio del gene. Questi esempi di dominanza per aploinsufficienza sono delle eccezioni ai classici rapporti di dominanza, poiché prevedono una loss of function.

Un dominante negativo è il risultato di mutazioni in geni i cui prodotti generano dimeri o multimeri, nell’esempio riportato in figura è mostrato il funzionamento di un dimero, in particolare è un recettore di membrana che in presenza del ligando può indurre autofosforilazione (o self fosforilation), che è un meccanismo classico nel signaling biochimico legato a ligandi, come fattori di crescita o fattori trofici, e loro recettori. In omozigosi wildtype si otterrà il 100% di recettore funzionante; mentre in caso di eterozigosità, con una mutazione che in questo caso è loss of function e provoca l’incapacità di autofosforilarsi, tra tutte le possibili combinazioni di prodotto, il 75% saranno dimeri che non possono autofosforilarsi anche se possono dimerizzare (il 50% di eterodimeri e il 25% di omodimeri con la mutazione) e si avrà solo il 25% di prodotto funzionante, che è inadatto a sostenere tutta l’attività della cellula.

La non complementazione del secondo sito è una delle eccezioni al test di complementazione e prevede la presenza di due mutazioni che separatamente in omozigosi presentano lo stesso fenotipo, ma che si trovano su due cistroni diversi, di conseguenza combinandoli e ottenendo il doppio eterozigote si dovrebbe osservare il fenotipo selvatico, ma ciò non avviene. Questo può accadere quando la mutazione coinvolge due geni che producono due enzimi diversi coinvolti nella stessa via metabolica, ad esempio: substrato A convertito nel substrato B dall’enzima 1, e substrato B convertito nel substrato C dall’enzima 2. In caso di eterozigosità del gene per l’enzima 1 si possiede il 50% dell’enzima 1 attivo, perciò il 100% del substrato A viene convertito in 50% di substrato B, se poi l’enzima 2 è presente in omozigosi wildtype allora tutto il substrato B viene convertito nel substrato C, ottenendo alla fine quindi il 50% di metabolita finale (rispetto a un individuo omozigote wildtype per entrambi i geni), sufficiente per garantire la sopravvivenza dell’individuo nel caso in cui il substrato C sia essenziale per la sopravvivenza. Invece, se entrambi i geni sono eterozigoti per la mutazione, il substrato A viene convertito al 50% nel substrato B, ma l’enzima 2 è presente in forma attiva solo al 50%, quindi viene prodotto il 25% di substrato C, di conseguenza viene notevolmente ridotto rispetto ai singoli eterozigoti e non è più sufficiente per la sopravvivenza. Si dice che i due geni sono funzionalmente legati.

Soppressione

È un concetto estremamente importante per la genetica, negli ambiti di soppressione e letalità sintetica si possono effettuare screening genetici (chiamati screening di soppressione o di letalità sintetica) che cercano di stabilire interazioni tra componenti, cioè fra geni o fra i loro prodotti.

La soppressione avviene in presenza di un’altra mutazione, ad esempio in presenza della variegazione da effetto di posizione, che si può osservare nell’occhio di Drosophila, e dipende da un’inversione a carico del cromosoma X che porta il gene white in prossimità dell’eterocromatina centromerica (quando prima era distale), con l’aggiunta di un ulteriore complicazione, ossia lo spostamento del limite del centromero in una posizione lontana. Questo è un problema perché l’eterocromatina caratterizza tutta la regione centromerica grazie a meccanismi di espansione, che però si fermano in presenza di componenti molecolari che stabiliscono il confine dell’eterocromatina, fermando quindi l’ondata di etero-cromatinizzazione. Questo processo è legato a modificazioni istoniche e ad altri meccanismi; di conseguenza spostando lontano il confine e avvicinando il gene white si ottiene come risultato che durante la divisione cellulare, quando si costituisce l’eterocromatina, l’espansione continui per un breve tratto per via dell’assenza del boundary nella posizione corretta, e ciò può far sì che white venga incluso nella porzione che viene convertita in eterocromatina; ma è stocastico, poiché in alcune cellule avviene e in altre no casualmente. L’occhio di Drosophila è formato da circa 800 ommatidi, che sono strutture dell’occhio composte da 8 cellule, e la pigmentazione si trova in ognuna di esse; nell’inversione alcune cellule non includono white nell’eterocromatina e in altre sì, rendendo il gene inattivo e quindi producendo un ommatidio bianco. Si chiama variegazione poiché è una variazione di colori legata al cambiamento della posizione di white rispetto al centromero (o dell’eterocromatina centromerica rispetto a white).

La variegazione in questo caso è la prima mutazione che avviene, che è data dall’inversione e dalla perdita del controllo sull’espansione dell’eterocromatina centromerica; invece, il fenotipo di soppressione è quello che ha subìto una seconda mutazione, su altro gene, che ristabilisce il fenotipo wildtype.