Genetica dei microrganismi

Genetica dei microrganismi

Introduction to bacterial genomes

Antoni Van Leeuwenhoek viene da tutti considerato il padre fondatore della microbiologia, in quanto è stato il primo a scoprire e a vedere i microrganismi, ma anche il primo ad avere la sperimentazione che gli ha permesso di studiarli e la prima persona in assoluto a fare degli esperimenti, per cercare di capire come e cosa facessero tali m.o. L. infatti negli anni 70 del 1600 costruiva artigianalmente dei microscopi con una sola lente e attraverso questi, nel 1674, vide in una goccia d’acqua quelli che lui chiamò “animalicules”, cioè piccoli animali.

Questi ultimi li descrisse poi attraverso una lettera che inviò alla Royal Society di Londra, che all’epoca era il punto di riferimento della comunità scientifica e questa lettera fu pubblicata poi nel 1677. In questa missiva, egli aveva fatto anche dei disegni rappresentanti questi piccoli animali, che lui aveva visto al microscopio e molti di questi erano in realtà dei protozoi (organismi eucariotici unicellulari); ma c’erano anche disegni di organismi di dimensioni inferiori, i quali potevano essere effettivamente dei batteri.

Chi sono i microrganismi?

Chi sono i microrganismi? Il termine “microrganismi” viene utilizzato per comprendere una grandissima varietà di organismi diversi, tra cui: batteri, archei (che sono il terzo dominio della vita, scoperto negli anni 70 del secolo scorso), organismi unicellulari appartenenti agli eucarioti (lieviti, alghe unicellulari), virus (particelle che non sono in grado di replicarsi, se non all’interno di una cellula ospite). I microrganismi di questo corso sono:

• Bacteria;
• Archea;
• Batteriofagi (virus che colpiscono i batteri).

Caratteristiche generali dei genomi batterici

Caratteristiche generali dei genomi batterici: i batteri sono gli organismi in assoluto più presenti sulla Terra come numero, ma anche come varietà.

Bacterial genomes

• 14,5 billions of years in 1 year:
• Mid-february: first microrganisms
• Mid-november: multicellular organisms
• End of November: first plants
• Mid-december: early mammals
• 31 december: our ancestors
• High variability
• Uncultivable bacteria
• 04/01/2021
• Closed genomes

From Hug et al. 2016, Nat Microbiol.

Se si pensa di riassumere i 14,5 miliardi di anni di storia della terra in un solo anno, i m.o. comparirebbero a metà febbraio; mentre i primi organismi eucariotici multicellulari soltanto a metà novembre; verso la fine di novembre comparirebbero le prime piante terrestri, a metà dicembre i primi mammiferi e soltanto il 31 dicembre, poco prima della mezzanotte, comparirebbero i nostri progenitori.

Questo ha favorito la loro maggiore presenza e diffusione sulla terra rispetto a tutti gli altri tipi di organismi. I batteri e gli archei, inoltre, hanno una grandissima capacità di vivere negli ambienti più disparati: nel nostro corpo e all’interno del corpo di qualsiasi altro organismo multicellulare e svolgono delle funzioni fondamentali; ad es. ci è impossibile digerire molti degli alimenti che mangiamo, in assenza dei microrganismi che si trovano nel nostro intestino.

La presenza di questi all’interno di ciascun organismo multicellulare è talmente importante che negli ultimi anni, quando si parla del genoma dell’individuo, non si prende in considerazione solo quello eucariotico dell’individuo stesso, bensì è stato introdotto un nuovo termine “OLOGENOMA”, che comprende nello studio del genoma di un individuo anche quello di tutti gli organismi che vivono all’interno dell’individuo stesso. Questo fa capire come tali m.o. siano fondamentali per la vita di tutti gli individui.

Questi, tuttavia, sono in grado di vivere in ambienti, in cui la maggior parte degli organismi eucarioti non è in grado di vivere: ad esempio in condizioni di temperature estreme sia molto alte che molto basse; o ancora in condizioni di pressione atmosferiche estreme, anche qui sia molto alte che molto basse; la stessa cosa per la salinità (ambienti molto salati o ambienti dolci) e questa loro capacità di vivere in più o meno tutti gli ambienti terrestri fa sì che si svolgano anche dei ruoli fondamentali per la vita nell’ambiente: sono coinvolti nella maggior parte dei cicli biogeochimici; svolgono funzioni fondamentali per la produzione di vari tipi di sostanze; ad esempio i batteri sono gli unici organismi sulla terra in grado di fissare l’azoto e trasformarlo dunque in una forma che può essere utilizzata dalle piante, animali, uomo.

Questa grandissima variabilità e funzionalità che hanno i batteri, in realtà non è ancora tanto conosciuta, perché la maggior parte dei batteri che abitano nel nostro pianeta sono sconosciuti, in quanto non coltivabili: cioè la maggior parte di batteri e archei non possono essere studiati in lab. È stato stimato che solo l’1% dei batteri presenti sulla terra sono coltivabili e quindi essere studiati in lab.

Negli ultimi anni, questo problema si è un po’ ovviato grazie all’avanzamento di tecnologie di sequenziamento di nuova generazione, che hanno permesso di recuperare campioni da una grandissima varietà di ambienti diversi e di sequenziare direttamente il genoma. Grazie al sequenziamento dei genomi è possibile conoscere l’esistenza di altri batteri, senza poterli effettivamente coltivare in laboratorio. L’unica informazione che si può avere però su quel batterio/archeo è il suo genoma, non si può sapere nient’altro.

L’albero filogenetico, nell’immagine sopra, è basato su tutti gli organismi di cui attualmente si conosce la sequenza del genoma e gli eucarioti rappresentano una parte minima in basso (in verde); mentre la maggior parte degli organismi di cui si ha il genoma completamente sequenziato sono archei, batteri; tutti quei rami dell’albero segnati con un punto rosso sono quegli organismi di cui si conosce l’esistenza grazie al sequenziamento del loro genoma, ma che non sono coltivabili in lab. Perciò della maggior parte dei batteri e degli archei si conosce il loro genoma, ma nient’altro che li riguardi.

Nella parte a destra si può vedere quanti sono i genomi attualmente sequenziati per batteri, archei, eucarioti e virus; i batteri sono gli organismi di cui si conosce il maggior numero di genomi e nonostante ciò le informazioni che si hanno sono ancora limitate.

Un altro fattore, oltre al problema della coltivabilità che limita sicuramente le conoscenze, è legato al fatto che molti dei genomi che sono stati sequenziati, appartenenti a batteri e archei, non sono genomi chiusi; cosa vuol dire questo? In generale, (studia bene sequenziamento di nuova generazione) per evidenziare quale sia il problema relativamente al sequenziamento dei genomi, queste tecnologie funzionano, nella maggior parte dei casi prendendo il genoma da sequenziare, frammentandolo in tanti pezzi, sequenziando questi piccoli pezzi che si ottengono e poi cercando di ricostruire la sequenza generale del genoma, basandosi sulle sovrapposizioni di sequenza dei vari pezzi.

È molto difficile però riuscire a ricostruire l’intera sequenza del genoma perché, anche se ci sono molte meno rispetto a quelle che si ritrovano nel genoma eucariotico, anche nei genomi dei batteri ci sono delle sequenze ripetute, che possono creare delle difficoltà nella costruzione dell’intero genoma. Talvolta, si sequenzia il genoma del batterio; si ottengono numerosi scaffold (quindi pezzettoni del genoma ricostruiti), senza però ricostruire l’intero genoma.

Questo è sufficiente nella maggior parte dei casi, perché permette di conoscere quali sono i geni presenti nel genoma, di ottenere vari tipi di informazioni; non permette però di sapere com’è fatto il genoma del batterio, da quali e quante molecole è costituito; quest’ultima è un’informazione che si può ottenere solo sui genomi effettivamente chiusi, di cui si conosce completamente l’intera sequenza.

Visione classica del genoma batterico

Classicamente si è sempre pensato (questa è una convinzione che è stata diffusa per moltissimi anni) che il genoma batterico fosse costituito da un solo cromosoma circolare di una dimensione compresa fra le 4-5 megabasi e che a questo unico cromosoma circolare potessero aggiungersi (ma non sempre) delle piccole molecole circolari non essenziali dette plasmidi.

Bacterial genomes.

Classical view of the bacterial genome.

Single circular chromosome, possibly including some smaller, non essential, circular plasmids.

Genome size 4,6 Mb.

Note: Kb/Mb - A kilobase (Kb) is 1000 bases of DNA, while a megabase (Mb) is 1,000,000 bases.

Questa visione dei genomi batterici è cambiata soltanto nell’ultimo decennio grazie al sequenziamento massivo di genomi, che ha permesso di capire che in realtà si trattava di una descrizione dei genomi batterici che riguardava, fondamentalmente, solo una parte di essi. Infatti, la definizione classica di genomi batterici era basata sul genoma di E.coli (il 90% di info che si hanno sui batteri deriva da E.coli; questo perché tale batterio è facilmente coltivabile in lab; perché è uno dei m.o. che viene studiato da più tempo) e per moltissimo tempo si è ritenuto che quello che riguardava E.coli in realtà riguardasse tutti gli altri batteri.

Molto spesso non è così, però di fatto E. coli può essere rimasto un fondamentale punto di riferimento. La visione generale classica dei genomi batterici basata su E.coli in realtà non è valida per tutti i batteri.

Different genome sizes

Innanzitutto le dimensioni dei genomi batterici possono variare moltissimo; il batterio con il genoma più piccolo che sia mai stato identificato vive all’interno di un insetto e prende il nome di Nasuia deltocephalinicola e ha un genoma di 0,1 Mb (mega paia di basi). Il batterio più grande che sia mai stato identificato è Sorangium cellulosum che ha invece 14 Mb.

Bacterial genomes.

Anche se si tratta sempre di genomi di dimensioni piccoli rispetto a quelli degli organismi eucarioti, come nel caso del genoma umano, o ancora dei genomi delle piante (dell’ordine di miliardi di pb). In realtà la dimensione dei genomi dei batteri può variare tantissimo, contrariamente a quello che si pensava originariamente.

1) Different genome sizes.

Nasuia deltocephalinicola 0,1 Mb.

Sorangium cellulosum 14 Mb.

Human genome 3,9* 10⁹ bp.

Both chromosomes and plasmids could be linear

Bacterial genomes.

Inoltre sia i cromosomi che i plasmidi dei batteri possono essere lineari, cioè quello che si pensava riguarda al fatto che tutti i cromosomi e tutti i plasmidi dei batteri sono circolari è stato confutato; ne sono un esempio i batteri del genere Streptomyces (che sono in grado di produrre molte molecole antibiotiche), che hanno sia un cromosoma che dei plasmidi lineari; un altro esempio è rappresentato da Borrelia burgdoferi (batterio che causa la malattia di Lyme, malattia provocata dalle punture delle zecche, molto diffusa in alcune parti del mondo, come USA e che se è presa in tempo non ha sintomi gravi, ma che se non curata può portare anche a dei sintomi molto gravi).

2) Both chromosomes and plasmids could be linear.

Borrelia burgdoferi.

Streptomyces spp.

1 chromosome and 21 plasmids.

Linear Chromosome and Plasmids.

(12 linear, 9 circular).

I batteri appartenenti a questa specie presentano un cromosoma e 21 plasmidi, di cui 12 lineari e 9 circolari. Per cui non solo i cromosomi e i plasmidi possono essere lineari, ma in uno stesso genoma si possono trovare sia molecole lineari che circolari.

Plasmids could have high size

Bacterial genomes.

Un’altra convinzione molto diffusa è che i plasmidi potessero essere solo di piccole dimensioni; anche questo si è rivelato essere non corretto, in quanto i plasmidi possono essere anche molto grandi e raggiungere le Mb; ad esempio nel caso di Sinorhizobium meliloti, che è uno dei batteri in grado di fissare l’azoto atmosferico e ha un plasmide di 1,6 Mb; o ancora Burkholderia cenocepacia che ha un plasmide di 0,88 Mb (è un batterio che si trova comunemente nell’ambiente e che è un patogeno opportunista, cioè non è in grado di causare patologie a persone sane, ma che può causare infezioni anche gravi a persone con sistema immunitario deficitario, come nel caso di pazienti immunocompromessi a causa della fibrosi cistica.

3) Plasmids could have high size (Megaplasmids, ranging in size from 100 to 1700 Kb).

Sinorhizobium meliloti (1,6 Mb).

Burkholderia cenocepacia (0,88 Mb).

Polyploidy

Bacterial genomes.

4) Polyploidy.

Azotobacter vinelandii:

Exponential growth: 2-4 copies.

Stationary phase: 50-100 copies.

Buchnera spp.:

The number of genome copies in each cell is related to the developmental stage of their host aphid.

Anche i genomi dei batteri, come quelli delle piante o di molti animali, possono essere caratterizzati da poliploidia, cioè si possono trovare nella stessa cellula più copie dello stesso genoma; come nel caso di Azotobacter vinelandii, che è un batterio del suolo, capace di fissare l’azoto e che presenta un numero di copie diverse del suo genoma a seconda della sua fase di crescita; nelle sue cellule sono presenti dalle 2 alle 4 copie del genoma durante la fase di crescita esponenziale e le copie del genoma possono diventare addirittura 100 durante la fase di crescita stazionaria.

L’altro esempio riguardano le specie appartenenti al genere Buchnera, in cui il numero di copie del genoma cambia a seconda dello stato di sviluppo dell’afide all’interno del quale questo batterio vive. Anche in questo caso non si sa bene il motivo per cui ci sono tante copie del genoma; probabilmente la presenza di tante copie dello stesso genoma è legata al fatto di poter risolvere i problemi legati a mutazioni deleterie che possono avvenire nel genoma.

More than one chromosome

L’ultima convinzione rappresentata dal fatto che il batterio potesse essere costituito da un solo cromosoma, si è rivelata anch’essa non essere corretta, in quanto i batteri possono possedere più di un cromosoma; come nel caso di Vibrio cholerae, batterio che può causare il colera e ancora le specie appartenenti al genere Bulkholderia.

Bacterial genomes.

5) More than one chromosome.

Vibrio cholerae.

Burkolderia spp.

Di tutti questi esempi, occorre ricordare che per molto tempo si è ritenuto che i genomi dei batteri fossero tutti uguali a quello di E.coli e cioè costituiti da un solo cromosoma circolare, a cui poteva più o meno associarsi la presenza di uno o più plasmidi di piccole dimensioni, per una dimensione totale del genoma compresa fra le 4 e le 5 Mb; ma in realtà il sequenziamento massivo del genoma negli ultimi anni ha permesso di vedere che la situazione nei genomi dei batteri è molto variabile a seconda degli organismi, per cui i genomi possono avere delle dimensioni molto variabili; possono essere costituiti da molecole sia circolari che lineari; possedere più copie dello stesso genoma all’interno della stessa cellula, e possono anche possedere plasmidi di grandi dimensioni e più cromosomi.

Genoma multipartito o genoma diviso

Ogni volta che il genoma di un batterio risulta essere suddiviso in più molecole, si parla di genoma multipartito o genoma diviso; cioè quando si ha un batterio, il cui genoma è costituito da un solo cromosoma, come quello di E. coli, si parla di “genoma unico”; quando si ha un batterio in cui il genoma è costituito da uno o più cromosomi oppure un cromosoma, un megaplasmide o più plasmidi, si parla di “genomi multipartiti”.

Multipartite genomes.

Multipartite or divided genomes.

Genome architecture consisting of a chromosome plus one or more additional large replicons.

Approximately 10% of the bacterial genomes contain several large and potentially essential replicons of either a circular or linear nature.

From Di Cenzo et al. 2017, Microbiol Mol Biol Rev.

Questi ultimi non sono tanto diffusi nei batteri; attualmente fra i genomi completamente sequenziati e chiusi (perché l’informazione su quante molecole costituiscono il genoma si può avere solo sui genomi chiusi), soltanto circa il 10% dei genomi noti hanno un genoma multipartito. L’albero filogenetico nella figura sopra mostra in rosso i genomi non multipartiti; quelli in cui è invece presente il nome, rappresentano i genomi multipartiti. Essi sono diffusi in più tipi di batteri e non in alcuni specifici.

Quando si parla di genomi multipartiti, si ha la presenza di più molecole diverse di DNA nello stesso genoma, o di più repliconi diversi; con il termine “replicone” si indica una molecola di DNA che si replica a partire da un’unica origine di replicazione e tutte le molecole di DNA, che siano esse plasmidi o cromosomi, megaplasmidi, che siano esse circolari o lineari che si trovano nei batteri.

Mentre, negli Archei, non è così; cioè le molecole di DNA degli Archei, così come quelle degli eucarioti, si replicano a partire da più di un’origine di replicazione. Per cui, ciascuna molecola di DNA presente in un batterio, può essere definita replicone. In generale, si definisce replicone primario il cromosoma principale; mentre tutti gli altri repliconi vengono definiti repliconi secondari.

Multipartite genomes.

Classification of bacterial replicons.

“Replicon” as a general term in reference to any DNA molecule regardless of its specific nature, and each replicon can be further classified based on specific characteristics.

The term “secondary replicon” refers to any replicon that is not the primary c