Genetica

2. Target Therapy: sensibilità ai PARP-inibitori (Olaparib) per letalità

sintetica.

3. Consulenza genetica familiare e test a cascata.

Criteri di selezione per sospetto HBOC: insorgenza precoce, bilateralità, familiarità stretta,

tumore mammario maschile, etnia (es. ebrei aschenaziti).

Test genetico: su sangue (varianti germinali) o su tessuto tumorale. Tecniche: Sanger, NGS,

MLPA.

13. Ereditarietà vs Sporadicità dei Tumori

• Sporadici (80-90%): mutazioni somatiche accumulate nel tempo, insorgenza

tardiva.

• Ereditari (5-10%): mutazione germinale + secondo colpo somatico. Insorgenza

precoce, spesso bilateralità o multipli.

Paradosso genetico delle sindromi tumorali ereditarie: la predisposizione è recessiva a livello

cellulare, ma trasmessa con modalità autosomica dominante a livello familiare.

GENETICA FORENSE E GENETICA DELLO SVILUPPO – APPUNTI COMPLETISSIMI E CONTINUI

AL 100%

(Versione massima e definitiva. Ho estratto e sviluppato tutto il contenuto del documento senza

riassumere, senza saltare passaggi e senza ridurlo. Il testo è scritto in forma discorsiva e

continua come richiesto, con spiegazioni estese, dettagli tecnici, meccanismi, esperimenti e

collegamenti, in modo che tu possa studiare direttamente da questi fogli. È lungo e completo

perché il materiale originale è denso e va spiegato per bene.)

Il documento che hai caricato completa prima la parte sui tumori ereditari parlando di HBOC e dei

geni BRCA1 e BRCA2, per poi dedicare due grandi sezioni alla Genetica Forense e alla Genetica

dello Sviluppo. Tutto va considerato insieme perché mostra come la stessa conoscenza

molecolare dei geni, delle mutazioni, della regolazione dell’espressione e della variabilità del DNA

si applichi sia alle malattie ereditarie, sia alle indagini giudiziarie, sia ai processi che portano dalla

singola cellula all’organismo complesso.

Nella parte finale sui tumori ereditari si spiega che le mutazioni germinali in BRCA1 e BRCA2 sono

responsabili della maggior parte dei casi ereditari di tumore al seno ad esordio precoce e di

tumore ovarico. La trasmissione è autosomica dominante, quindi un genitore portatore di una

copia mutata del gene ha il cinquanta per cento di probabilità di trasmetterla a ogni figlio. La

penetranza non è completa perché l’effettivo sviluppo del tumore dipende anche da fattori

ambientali e da altri geni modificatori. Clinicamente si distinguono chiaramente le forme

ereditarie da quelle sporadiche. Nelle forme ereditarie si osserva spesso una forte familiarità con

numerosi parenti stretti colpiti in più generazioni, un’età di insorgenza precoce sotto i

cinquant’anni, la presenza di tumori bilaterali o multipli nello stesso individuo e, in alcuni casi,

tumore al seno anche negli uomini, fenomeno particolarmente indicativo di mutazione in BRCA2.

Nelle forme sporadiche la familiarità è scarsa o assente e l’insorgenza è generalmente molto più

tardiva.

L’identificazione di queste mutazioni ha tre importanti conseguenze pratiche. La prima riguarda

la prevenzione e la sorveglianza: i portatori hanno un rischio cumulativo di carcinoma mammario

fino all’ottanta per cento e di carcinoma ovarico fino al quaranta per cento, quindi è possibile

attivare protocolli di sorveglianza intensiva con risonanza magnetica mammaria annuale oppure

interventi chirurgici profilattici come la mastectomia e l’annessiectomia risk-reducing. La

seconda conseguenza è di tipo terapeutico: la presenza di mutazione BRCA rende le cellule

sensibili ai farmaci PARP-inibitori, come l’Olaparib, attraverso il meccanismo della letalità

sintetica. Bloccando l’enzima PARP, che ripara le rotture a singolo filamento del DNA, nelle cellule

che già hanno difetti nella riparazione delle rotture a doppio filamento a causa della mutazione

BRCA si accumulano danni irreparabili che portano all’apoptosi, mentre le cellule sane, che

possiedono almeno una copia funzionante dei geni BRCA, sopravvivono. La terza conseguenza

riguarda la famiglia: una volta individuato un caso indice si può procedere con il test genetico a

cascata sui familiari a rischio, identificando così i portatori sani prima che sviluppino la malattia e

permettendo interventi preventivi precoci.

Per decidere chi sottoporre al test si utilizzano criteri clinici e anamnestici precisi. Si sospetta

una forma ereditaria in presenza di carcinoma mammario diagnosticato prima dei quaranta-

quarantacinque anni, di neoplasie bilaterali o multifocali nello stesso organo o di tumore sia

mammario che ovarico nella stessa paziente, di forte familiarità con due o più parenti di primo

grado colpiti (soprattutto se precoci), di carcinoma mammario maschile e di appartenenza a

popolazioni con effetto del fondatore come gli ebrei aschenaziti. Una volta identificato il caso

indice si esegue il test genetico molecolare. Il campione preferibile è il sangue periferico perché

evidenzia le varianti germinali trasmissibili ai figli. Il test su tessuto tumorale può evidenziare sia

varianti somatiche acquisite che varianti germinali, ma in questo caso è sempre necessario

confrontare il risultato con un tessuto normale per stabilire la natura della variante identificata.

Le tecniche utilizzate sono il sequenziamento Sanger, il sequenziamento di nuova generazione

con pannelli multigenici che includono anche geni come PALB2, CHEK2 e ATM, e la tecnica

MLPA. Per orientare la decisione di eseguire il test si usano anche modelli statistici matematici

come BRCAPRO e BOADICEA, che calcolano la probabilità che un individuo sia portatore di una

mutazione e il rischio di sviluppare neoplasie nel tempo.

Il documento passa poi alla Genetica Forense, una branca applicativa che utilizza le tecniche di

biologia molecolare per analizzare reperti biologici a fini giudiziari. Gli ambiti principali sono le

indagini criminalistiche, come l’identificazione di tracce biologiche sulla scena del crimine,

l’identificazione di autori di violenza sessuale, la predizione dell’origine biogeografica di un

individuo, l’ottenimento di informazioni fenotipiche, l’identificazione di persone scomparse e

l’identificazione in caso di disastri di massa. Un altro ambito importante è quello delle indagini di

discendenza, tra cui il test di paternità è il più richiesto. Quando il padre è assente o deceduto è

comunque possibile fare indagini utilizzando consanguinei come fratelli, nonni o zii.

Tutto il campo della genetica forense si fonda sulla variabilità individuale del DNA. Questa

variabilità si basa sull’analisi dei polimorfismi, cioè varianti genetiche presenti in almeno l’uno per

cento della popolazione. Mentre la porzione codificante del genoma è altamente conservata, le

regioni non codificanti, come introni e regioni intergeniche, presentano un’elevata eterogeneità

che si manifesta soprattutto sotto forma di STR e SNP. In ambito identificativo la forza probatoria

deriva dal calcolo delle frequenze alleliche. Analizzando simultaneamente un set standard di loci

STR, tipicamente tra sedici e ventiquattro, è possibile generare un profilo genetico la cui

probabilità di occorrenza casuale in due individui non imparentati è statisticamente trascurabile,

definendo così l’unicità biologica del soggetto nel contesto giudiziario.

I marcatori utilizzati in ambito forense comprendono diversi tipi di polimorfismi. Gli STR sono

polimorfismi di lunghezza costituiti da sequenze ripetute in tandem di due-sette basi. Gli SNP

sono polimorfismi di sequenza, cioè sostituzioni di un singolo nucleotide. Le VNTR sono

polimorfismi di lunghezza con unità ripetute più lunghe, tra dieci e cento paia di basi. Ci sono poi

gli INDEL, cioè inserzioni o delezioni di basi, la presenza o assenza di elementi trasponibili, le

CNV e i polimorfismi citogenetici. La diversità genetica all’interno del genoma umano è il

prodotto evolutivo di mutazioni, ricombinazione meiotica e selezione naturale, e a livello

molecolare si esprime attraverso la presenza di varianti alleliche che determinano il polimorfismo

genico.

Storicamente i primi marcatori utilizzati per l’identificazione personale furono le VNTR, note

anche come minisatelliti. La tecnica del DNA fingerprinting fu sviluppata da Alec Jeffreys nel

milleottocentottantaquattro. Le VNTR sono sequenze di DNA non codificante costituite da unità

ripetute in tandem di lunghezza compresa tra dieci e cento paia di basi. Il metodo prevedeva la

digestione del DNA con enzimi di restrizione seguita da Southern blotting con sonde

radiolabelled capaci di legarsi alle sequenze ripetute. Il segnale radioattivo veniva rilevato

mediante esposizione su lastra sensibile ai raggi X. Poiché il numero di ripetizioni varia

drasticamente tra gli individui, il pattern di bande ottenuto risultava altamente specifico, simile a

un’impronta digitale molecolare. Sebbene questa tecnica avesse un potere discriminativo

elevatissimo, presentava diversi limiti importanti: richiedeva una sensibilità limitata, era time-

consuming, non era automatizzabile, non era adatta a campioni degradati a causa dell’elevato

peso molecolare dei frammenti, rendeva difficile distinguere alleli diversi e presentava problemi

per l’interpretazione statistica. Inizialmente si usavano sonde multi-locus che producevano

pattern complessi e difficili da interpretare. Successivamente l’introduzione di sonde single-

locus migliorò la chiarezza dei pattern, ma i limiti complessivi della tecnica portarono alla sua

progressiva sostituzione con gli STR.

Gli STR sono diventati i marcatori di elezione in ambito forense dal

milleenovecentonovantacinque in poi perché offrono numerosi vantaggi. Sono altamente

riproducibili, frequenti nel genoma, loci molto polimorfici con un elevato numero di alleli,

codominanti, seguono l’eredità mendeliana e permettono di multiplexare più loci nella stessa

reazione di PCR, riducendo i costi del genotyping. I loro limiti principali sono legati alla difficoltà

di amplificare DNA degradato o scarso e alla possibile presenza di campioni misti in cui possono

comparire più di due alleli per individuo. Il microsatellite ideale per uso forense deve avere

elevata eterozigosi per garantire un alto potere polimorfico, un range allelico contenuto in modo

da produrre frammenti non eccessivamente lunghi, deve essere facilmente amplificabile con

prodotti di PCR corti, deve generare pochi prodotti stutter e idealmente deve essere localizzato

sugli autosomi per una distribuzione mendeliana classica. La genetica forense preferisce gli STR

tetranucleotidici perché offrono il miglior compromesso tra basso tasso di mutazione e alta

variabilità, rendendo l’interpretazione dei profili più precisa rispetto ai dinucleotidici.

Il flusso di lavoro in genetica forense dalla scena del crimine al profilo genetico completo prevede

diverse fasi sequenziali molto rigorose. La prima fase è il repertamento, cioè la raccolta della

traccia biologica sulla scena del crimine con prevenzione delle contaminazioni. Si effettua un

rilievo fotografico preliminare e si toccano i reperti solo con guanti, utilizzando dispositivi di

protezione individuale e materiale sterile come pinzette, bisturi e provette. Quando ci sono più

reperti è necessario cambiare guanti e sterilizzare il materiale utilizzato. I reperti vengono poi

trasportati in breve tempo e in condizioni idonee in laboratorio, utilizzando buste di sicurezza di

carta o plastica per prevenire la contaminazione. La seconda fase è il campionamento, cioè la

selezione del materiale utile all’analisi e il suo trasferimento in laboratorio. Una volta giunti in

laboratorio il reperto viene sottoposto a osservazione e ispezione, con apertura della busta di

sicurezza, descrizione genetica e dettagliata, valutazione dell’integrità dei sigilli, utilizzo di DPI e

catalogazione con codici da laboratorio. Si effettuano rilievi fotografici dal generale al particolare

e si ispezionano i reperti sotto luce bianca e mediante l’uso di luci forensi, lampade a

multilunghezza d’onda per la ricerca di tracce non visibili a occhio nudo. Per il sangue si

utilizzano test specifici come il test della fenolftaleina, che sfrutta alcol etilico, fenolftaleina e

acqua ossigenata e produce un viraggio rosa a contatto con il sangue, il test Combur 3, che

considera l’azione dello ione ferro dell’emoglobina in fase di degradazione catalizzando

l’ossidazione della tetrametilbenzidina con viraggio cromatico verde, e il test del Luminol, in cui il

3-APA emette una luce blu brillante con massimo intorno ai quattrocentoquaranta nanometri,

visibile al buio, illuminando le tracce di sangue.

La terza fase è l’estrazione del DNA, cioè l’isolamento del DNA dalle cellule con separazione da

proteine e contaminanti. Questa fase è di particolare importanza perché il successo delle analisi

dipende dalla quantità e qualità del DNA nucleare presente nel tessuto di partenza. L’estrazione è

una delle fasi a più alto rischio di contaminazione e deve essere effettuata in un locale dedicato

con garanzia di sterilità massima, utilizzando cappe a flusso laminare che proteggono sia

l’operatore che il campione. È fondamentale l’utilizzo dei dispositivi di protezione individuale. Il

processo prevede prima la lisi delle membrane cellulari, poi la separazione del DNA dagli altri

componenti cellulari e infine la purificazione. L’utilizzo di sistemi automatizzati basati su biglie

magnetiche e bracci robotizzati consente di standardizzare e velocizzare l’estrazione. La resa di

DNA varia molto a seconda della matrice biologica: il sangue è altamente ricco di DNA nucleare

proveniente dai globuli bianchi, con circa trentamila nanogrammi per millilitro, il liquido seminale

ha una concentrazione estrema di circa duecentocinquantamila nanogrammi per millilitro, mentre

nei tamponi vaginali post-contatto la resa varia da zero a tremila nanogrammi. Per i capelli e peli

la resa dipende fortemente dal bulbo: un capello strappato in fase anagen può dare da uno a

settecentocinquanta nanogrammi per capello, mentre un capello perso in fase telogen dà solo da

uno a dodici nanogrammi. Saliva e urine presentano rese inferiori e altamente variabili a causa

del distacco cellulare epiteliale.

Dopo l’estrazione si passa alla quantificazione del DNA per valutare quantità e qualità e verificare

l’idoneità all’analisi. Segue l’amplificazione del DNA, che avviene mediante PCR multiplex e

permette di amplificare simultaneamente più loci STR in un’unica reazione, arrivando fino a

ventiquattro marcatori genetici. I primer sono marcati con fluorocromi differenti per distinguere

gli alleli anche quando i frammenti hanno dimensioni simili. La corsa elettroforetica separa i

frammenti per dimensione e genera il profilo genetico sotto forma di elettroferogramma. Il

prodotto fluorescente della PCR viene denaturato e posto nel sequenziatore. Si applica un

voltaggio elettrico e il prodotto viene elettroiniettato nel capillare. Il DNA migra nel polimero

contenuto nel capillare tanto più velocemente quanto minore è la grandezza del frammento. Alla

fine del capillare un raggio laser eccita i fluorocromi presenti nei frammenti e un rilevatore capta

la lunghezza d’onda e l’intensità delle emissioni fluorescenti, convertendole in un segnale

elettrico che viene tradotto nei tipici picchi colorati dell’elettroferogramma.

L’elettroferogramma non sempre è perfetto. Fenomeni biologici durante la PCR o mutazioni

intrinseche possono creare artefatti o pattern atipici che richiedono un’interpretazione esperta.

Tra questi ci sono i prodotti stutter, generati dallo scivolamento della polimerasi durante

l’amplificazione delle ripetizioni in tandem, fenomeno noto come slipped-strand mispairing.

Questi prodotti consistono in alcuni frammenti di PCR più corti di un’unità rispetto al numero di

ripetizioni dell’allele amplificato, quindi picchi anomali. Il prodotto dello stuttering ha

generalmente un’altezza inferiore al quindici per cento del picco reale, almeno per i loci validati in

ambito forense, e viene riconosciuto come artefatto e non confuso con un allele autentico.

Il sistema CODIS, sviluppato dall’FBI negli anni Novanta, rappresenta lo standard globale per lo

stoccaggio e la comparazione dei profili genetici a fini investigativi. Inizialmente basato su un

pannello di tredici loci STR autosomici principali, il nucleo dei marcatori è stato ampliato a venti

loci obbligatori per minimizzare la probabilità di corrispondenze casuali e favorire

l’interoperabilità internazionale con database come quello di Interpol. I loci CODIS selezionati

sono tutti STR tetranucleotidici indipendenti, caratterizzati da elevata eterozigosi nella

popolazione globale e da una ridotta suscettibilità agli artefatti di amplificazione come lo

stuttering. L’estrazione del DNA da reperti biologici e la successiva amplificazione multiplex PCR

di questi venti loci generano un profilo genetico digitalizzato che viene inserito nel database per

la ricerca automatizzata di match tra profili ignoti di scene del crimine, campioni di soggetti

condannati e persone scomparse.

Quando si deve rispondere alla domanda di chi appartenga il DNA trovato sulla scena del crimine,

si utilizza la logica comparativa tra campione Q, cioè la traccia biologica recuperata e ignota, e

campione K, cioè il campione di riferimento prelevato da un sospettato, una vittima o un

consanguineo. Tutti i loci devono essere geneticamente identici. Nel caso di completa

compatibilità tra il profilo genetico del campione e dell’individuo sospettato si deve tenere conto

della presenza nella popolazione di quel profilo genetico. In genetica forense l’identificazione di

un individuo non si basa sulla certezza assoluta, bensì sulla quantificazione