Farmacologia generale - metabolismo epatico dei farmaci

Capitolo 8: Metabolismo dei farmaci

Il metabolismo dei farmaci è essenzialmente un meccanismo di difesa di un organismo vivente contro composti esogeni estranei e non essenziali ai processi vitali: xenobiotici, estranei alla vita.

La finalità è di inattivare dette sostanze (detossificazione) e, contemporaneamente, di renderle più facilmente eliminabili. Qualche volta la biotrasformazione può aumentare l'attività biologica della sostanza in circolo: si parla, allora, di profarmaci, qualora venga potenziata l'attività terapeutica desiderata; o veleni potenziali qualora la nuova attività o l'incremento di attività così acquisiti non siano desiderati. In qualche caso i metaboliti sono dotati di un quadro di attività farmacologica parzialmente sovrapponibile a quello del composto di origine; questa evenienza darà luogo ad una durata d'azione maggiore, che deve suggerire un adeguato protocollo terapeutico.

Le trasformazioni metaboliche normalmente portano ad un aumento di idrofilia degli xenobiotici, facilitando così la loro eliminazione per le vie più comuni, come renale, biliare, fecale, essudativa; al contrario le vie meno utilizzate come la polmonare e la traspirativa richiedono diminuzione della polarità e del peso molecolare in modo da diminuire la tensione di vapore.

Fra gli xenobiotici che suscitano una risposta di difesa metabolica, se non immunitaria, si possono ricordare:

• Farmaci e sostanze di sintesi
• Polveri e solventi
• Fumo e bevande
• Veleni e tossine
• Precancerogeni e cancerogeni ...

Data la natura enzimatica delle trasformazioni metaboliche, gli enzimi devono essere caratterizzati da una grande adattabilità alla struttura di un substrato così variabile come imprevedibile. Questa versatilità è ottenuta con uno o più dei seguenti fattori: a) polimorfismo genetico, cioè dotazione genetica di numerose isoforme; b) polimorfismo inducibile, rapida proliferazione di nuove isoforme stimolata dalla presenza dello xenobiotico stesso; c) induzione metabolica, aumento dell'attività enzimatica (dovuta ad aumento della sintesi di enzimi metabolici) in seguito ad esposizione a xenobiotici; d) ridotta selettività nei confronti del substrato.

Fattori che influenzano la capacità metabolica

• Genetici: 1) Differenze di specie e individuali
• Fisiologici: 2) Età, sesso, gravidanza, malattie: insufficienza epatica (riduzione del corredo di enzimi epatici e digestivi).
• Farmacodinamici: 3) Protocollo terapeutico, distribuzione tissutale, combinazione con proteine, effetto di primo passaggio (vedi)
• Ambientali: 4) Competizione con altre sostanze, avvelenamento di sistemi enzimatici
• Attività della flora batterica intestinale: 5) Ad esempio fornisce glucuronidasi che rilibera il farmaco dall'escreto biliare che così viene riassorbito dall'intestino; bioattivazione di precursori inattivi (cancerogeni da precancerogeni). Tempo di permanenza nell'intestino...
• Forma farmaceutica: 6)

Fasi metaboliche

Si consulti un testo di Fisiologia per una sommaria descrizione di queste funzioni escretorie.

Il metabolismo dei farmaci si attua attraverso due fasi:

Fase di funzionalizzazione

Fase di funzionalizzazione, attuata attraverso i seguenti tipi di reazioni:

• Reazioni di fase I che introducono nella molecola del farmaco nuovi gruppi idrofili e/o protici (come OH, NH₂, COOH, SH ...)
• Reazioni di ossidazione
• Reazioni di idrolisi: che liberano detti gruppi idrofili da eteri, esteri, ammidi, acetali, emiacetali, epossidi ...
• Reazioni di riduzione: meno diffuse, che possono generare alcuni di detti gruppi idrofili o protici

Scopo funzionale: rendere più idrofilo il composto estraneo per facilitarne l'eliminazione, inattivare il composto, preparare il substrato per la Fase II.

Fase di coniugazione

Fase di coniugazione, attuata attraverso i seguenti tipi di reazioni:

• Reazioni di fase II
• Reazioni di coniugazione: accoppiamento con piccole biomolecole ionizzabili o altamente idrofili, come: Ac. Glucuronico, Ac. Solforico, Aminoacidi, Glutatione ...
• Reazioni di coniugazione con bioreagenti apolari: Metilazioni, Acilazioni

Scopo funzionale:

• Inattivare e rendere nettamente idrofilo per una completa eliminazione
• Inattivare e/o aumentare il peso molecolare per facilitare l'eliminazione biliare

Reazioni enzimatiche di ossidazione

Il sistema enzimatico più diffuso per l'ossidazione di xenobiotici è il Citocromo P450, chiamato anche CYP450, monoossigenasi, ossidasi o idrossilasi. È localizzato nella frazione microsomiale di fegato, rene, polmone, intestino ...

Costituito da: Eme-Proteina: responsabile del trasporto di e^- e attivazione di O₂; NADPH associato a NADPH-citocromo reduttasi e altri cofattori.

Differenziatosi geneticamente per metabolismo di steroidi e acidi biliari, è in tutte le specie viventi caratterizzato da spiccato polimorfismo genetico e polimorfismo inducibile e costituisce così uno dei più versatili sistemi di difesa da sostanze estranee alla biologia cellulare.

Famiglie di CYP450

Sono state identificate più di 110 famiglie di CYP450 per le quali viene adottata la seguente nomenclatura: CYP seguito da:

• 1° Numero, che indica la famiglia con membri presentanti circa il 35% di omologia
• Lettera maiuscola, indica la sottofamiglia caratterizzata dal presentare il 40-60% di omologia
• 2° Numero, sottotipo con omologia ancora più elevata

Alcuni tipi di CYP450 e relativo substrato

Alcuni Tipi di CYP450, e relativo substrato (da non memorizzare):

Il nome deriva dal fatto che la forma ridotta con Fe²⁺ lega monossido di carbonio per dare un complesso con un massimo di assorbimento a 450 nm (nel blu).

• CYP1A1 Idrocarburi Policiclici Aromatici, Arilamine, Estrogeni. Indotta da fumo di tabacco e da detti idrocarburi aromatici
• CYP1A2 Arilamine, Nitrosamine, Idrocarburi Aromatici. Indotta da fumo di tabacco
• CYP2A6 Cumarine, Aflatossina B1. Testosterone (nel Ratto) →
• CYP2D6 Numerosi farmaci: amine lipofile binding a coppia ionica. Stereoselettiva, non inducibile. Inibita dalla chinina
• CYP2E1 Alogenoderivati e piccole molecole (etanolo, benzene, acetonitrile, DMF ...
• CYP3A... Molto numerosa …

N.B. La sequenza aminoacidica dell'eme-proteina determina l'affinità dell'enzima per una determinata classe chimica di substrato: la presenza di AA apolari come leucina, isoleucina e valina in prossimità del centro catalitico può formare una sacca lipofilica in grado di legare sostanze apolari; la presenza di fenilalanina determina affinità per idrocarburi aromatici, residui di AA bicarbossilici (glutamato e aspartato) tendono a legare composti con centri cationici, al contrario residui di AA tipo lisina e arginina determineranno affinità per i composti carichi negativamente...

Inibizione del CYP450

• Inibitori reversibili: monossido di carbonio, fluorochinoloni, cimetidina, …
• Inibitori complessanti: complessano gli intermedi del ciclo catalitico del CYP450 e sono nitrosoalcani, antibiotici macrolidici, …
• Inibitori irreversibili: inibizione “suicida” o inibiz. basata sul metabolismo, cioè l'enzima produce dei metaboliti che lo inattivano. Questi metaboliti sono radicali formati da alcheni, alchini, da aloalcani ..., da ormoni androgeni e progestinici, epossidi e acilalogenuri da polialogenoderivati (vedi avanti).

Centro catalitico ferro(III) eme tiolato

La carica del ferro trivalente (N° di coordinazione 6) è neutralizzata da due cariche negative su due atomi di azoto pirrolici NNR S 3 del nucleo porfirinico (dove per brevità le catene laterali sono Fe omesse) e la terza carica negativa è sullo zolfo di un residuo di OH₂ cisteina della porzione proteica del citocromo. Il sesto legando è NN una molecola di acqua, debolmente legata, che appunto nel ciclo catalitico viene sostituita dall'ossigeno.

Ciclo ossidativo

a) Il substrato R-H viene adsorbito su una regione proteica dal CYP450-[Fe(III)].

b) Il Fe(III) del gruppo eme, dopo riduzione a Fe(II) da parte del NADPH, lega una molecola di ossigeno che prende il posto della molecola di acqua. Dopo una serie di reazioni in sequenza nelle quali interviene altro NADPH si genera la forma del CYP450 cataliticamente attiva per l'ossigenazione: Fe(V)=O, ossene perferrile con Fe a numero di ossidazione 5+ e ossigeno con caratteristiche di biradicale ovvero di ossigeno—O—atomico.

Il Ferro-eme, analogamente a quello della emoglobina, per poter legare l'ossigeno molecolare deve essere ridotto a Fe(II), cioè ferro a numero di ossidazione 2+.

c) L'ossene perferrile strappa un atomo di idrogeno dal substrato in modo da formare il radicale R—; la probabilità e le percentuali relative dei vari possibili radicali dipende dalla rispettiva stabilità e dalla libertà sterica. Si ricorda che i radicali, come i carbocationi, sono stabilizzati da effetti a rilascio elettronico. Il Fe si riduce a 4+ fornendo il perferril-idrossido, Fe(IV)-OH, dove ha carattere di radicale—OH.

d) Accoppiamento radicalico fra R— e —OH. Il Fe ritorna a numero di ossidazione 3+.

e) Rilascio del prodotto ossidrilato R-OH e rigenerazione del CYP450.

RHSCHEMA 1 Ciclo ossidativo del CYP450[Fe(II)HO]P P[Fe(II)RH]450 2 450 eO H -2 2+ROH 2HO2P[Fe(V)=ORH]P[Fe(II) ROH] 450450 [Fe(IV)OHR]P450

I passaggi sopra descritti possono essere riassunti dalle seguenti equazioni, dove —O— sostituisce il perferril-ossene e il perferril-idrossido: —OH

→O + 2H + 2 e + H O^{+ -} —O—_{2 2} → →+ R-H [ R— + R-OH—O— —OH]

→+ -O + 2H + 2e R-OH + H O_{2 2}

Ossidazione di catene alchiliche

Le catene alchiliche sono più reattive dei residui arilici nelle reazioni radicaliche: il centro radicalico viene stabilizzato da effetti di risonanza (coniugazione con legami π), iperconiugativi (coniugazione con legami C-H) ed induttivi, come dal seguente prospetto:

≅ Stabilità del radicale carbocatione

• Allilico > benzilico > C^III > C^II > C^I > arile

Potenziato da vicinanza di metili: Effetto iperconiugativo

• Me₃C · > Me₂CH · > MeCH₂ · > RCH₂CH₂ · > R₂CHCH₂ · > R₃CCH₂ ·

Reattività per Impedimento Sterico

• C^I > arile > C^II > C^III (più deboli ma opposti agli effetti precedenti)

Meccanismo dell'ossidazione enzimatica di radicali alchilici

Lo schema sotto riportato illustra una tipica ossidrilazione di una catena alchilica che procede con un meccanismo radicalico come già descritto in precedenza. Un eventuale prodotto secondario può derivare dalla deidrogenazione ossidativa con introduzione di un doppio legame; questa via metabolica è facilitata da carbocationi intermedi stabili e impediti stericamente ad avvicinarsi al sito catalitico.

SCHEMA 2 Fe(III) OHCH (Principale)Fe(IV) OH CH₂CH CH₂CH CH₂ 2Fe(V)=O CHFe(IV) OH CHFe(IV) OH CHCH₂Fe(III) OH Fe(III) OH Fe(III)

Ad es. nei barbiturici la resistenza dei residui idrocarburici in C5 è determinante per la durata del sonno da questi indotto: raggiunge una durata di 12 h con il fenobarbitale e di 4-6 h con gli altri in accordo con la rispettiva emivita come sotto riportato.

SCHEMA 3'' 43 H OH O3 H O CH H O3 CH'CH CH ' 332 3 '1 ' 31NN N CH CH NCH CH 2 2 CH CH2 2CH5 O CH CH' 'O O 2 31 2 OCH CHCH CH CH CH 3N CH CH2 3N 2 3N 3N1 H CHH H 3O HO O O

Fenobarbitale Amobarbitale
Pentobarbitale Aprobarbitale
t = 80-100 h t = 10-30 h
t = 15-50 h t = 14-34 h
1/2 1/2
1/2 1/2

Nel fenobarbitale il gruppo CH₂ legato al sistema eterociclico dà radicali poco stabili per l'effetto elettronattrattore di detto anello; più disponibili per l'ossidrilazione da parte del CYP 450 rimangono il CH₃ e il fenile, relativamente poco reattivi.

Nel Pentobarbitale è presente un radicale ramificato, 1'-metilbutile; tuttavia il carbonio terziario 1', oltre che risentire del risucchio di elettroni da parte dell'eterociclo, è stericamente più impedito dei C secondari 2' e 3', dei quali è preferito 3' per il minor ingombro e per l'iperconiugazione con il metile 4'.

Nell'aprobarbile il carbonio più reattivo verso l'ossidrilazione radicalica è l'1' in posizione allilica: l'efficace stabilizzazione per risonanza compensa e supera l'inattivazione da parte dell'eterociclo.

Nell'amobarbitale il centro più attivo per l'ossidrilazione è il C3' del radicale isoamilico: è terziario, è inoltre lontano dall'eterociclo ed adiacente a due metili.

Si può concludere che nei barbiturici, come in altri composti, l'introduzione di ramificazioni o di insaturazioni nei sostituenti in C5 riduce sensibilmente la loro durata d'azione per essere metabolizzati più velocemente ed estensivamente.

Ossidazione anelli aromatici

Come si è accennato in precedenza i residui aromatici sono più resistenti all'ossidazione radicalica rispetto a residui alifatici. In ogni caso la loro reattività è alquanto variabile, risentendo sensibilmente della presenza di sostituenti e degli ingombri sterici quasi in maniera parallela alle stesse reazioni condotte in ambiente chimico. I sostituenti a rilascio elettronico stabilizzano i radicali e, particolarmente, i carbocationi intermedi della reazione enzima