Tossicologia - prima parte

Riassunto di tossicologia

Tossicità genetica

Il DNA è poco accessibile, ma può essere comunque alterato. Si parla di danno e di lesioni che vengono ad essere indotte a livello del DNA ai suoi vari livelli di complessità organizzativa. Del DNA ne esiste una struttura primaria, una secondaria e una terziaria, qui si parla di alterazioni indotte a livello della struttura primaria del DNA.

Il DNA può essere attaccato con una moltitudine di meccanismi, la tossicità genica si occupa delle conseguenze di questo attacco, per cui potremo avere attacchi a livello di un sito purinico, pirimidinico, ci può essere una rottura a singolo filamento o doppio filamento, ci possono essere prodotti di addizioni o altri meccanismi che vedono l’intercalazione; quindi, in sostanza i meccanismi primari sono diversificati (questa è la reazione primaria), e la tossicità genetica valuta le conseguenze. Studia l’alterazione della struttura primaria del DNA e le mutazioni. L’evento è caratterizzato in base di tempi, dosi e conseguenze.

Definizione tossicità genetica: è acuta, dose-indipendente, stocastica, indotta da agenti chimici e fisici altamente specifici per l’interazione con gli acidi nucleici e che inducono mutazioni a concentrazioni non citotossiche.

Questo evento può colpire tutti i tipi di cellule:

• Cellule germinali (ereditabili): sterilità, morte fetale, teratogenesi.
• Cellule somatiche (non ereditabili): alterazioni cellulari, tumori.

I danni inizialmente indotti a livello della doppia elica possono essere riparati e non uccidere la cellula, le mutazioni invece sono un punto di non ritorno biologico. Per definizione le mutazioni sono alterazioni stabili e irreversibili indotte a livello della struttura primaria del DNA a concentrazioni sub-citotossiche. È stabile perché una volta che la cellula le ha acquisite non possono essere più riparate, sono irreversibili ed è legato all’effetto.

Principali eventi mutazionali

Il DNA ha una complessità dal punto di vista strutturale; infatti, vengono classificate in base al livello che intaccano in:

• Mutazioni geniche → sono stabili e irreversibili.
• Aberrazioni cromosomiche.
• Alterazione nel numero di cromosomi.

Per mutazioni geniche l’alterazione strutturale riguarda singoli geni, si parla di mutazioni puntiformi relative a singole coppie di basi. Le aberrazioni cromosomiche sono alterazioni strutturali dei cromosomi, quindi ci si riferisce a segmenti con diversi geni.

Alterazioni strutturali

Principali tipi di mutazioni geniche:

• Base-pair substitution, alterazioni delle singole coppie di basi di tipo qualitativo, per esempio un’adenina si scambia con una citosina o guanina.
• Frame shift mutations sono alterazioni di tipo quantitativo, inserzione o delezione di una coppia di basi.
• Transizioni → una purina è sostituita da un’altra purina (G:C→A:T, A:T → G:C).
• Transversioni: una pirimidina si sostituisce con una purina (C:G A:T)→.

Tutte le mutazioni hanno un peso biologico, ovviamente le mutazioni a livello di singole coppie di basi sono le meno impattanti, però sono abbastanza pericolose perché possono essere non viste dal network molecolare. Indurre una mutazione genica può essere un vantaggio dal punto di vista delle conseguenze biologiche. Un esempio è l’esposizione ad acido nitroso, che si lega all’adenina nitrosandola, l’adenina nitrosata diventa come affinità chimica uguale all’ipoxantina. Per cui se l’adenina iniziale si sarebbe appaiata alla timina, l’ipoxantina, uguale alla guanina, si appaia alla citosina.

Principali tipi di aberrazioni cromosomiche distinguibili nella mitosi

Si osservano i cromosomi in metafase (condensazione della cromatina).

La struttura primaria viene ad essere rotta, ci possono essere semplici rotture delle parti terminali delle braccia cromatidiche con formazione di un frammento acentrico, questi frammenti acentrici possono essere più grandi o più piccoli e a seguito alla rottura si può avere la chiusura della parte più grande del cromosoma che unisce le porzioni terminali e configura la struttura ad anello. La parte del segmento di rottura può riunirsi e formare una struttura ad anello, oppure ci può essere un meccanismo pericoloso perché si ha una rottura delle braccia cromatidiche con la formazione del frammento acentrico, che migra e si fonde con le braccia cromatidiche opposte.

1 pericentric inversion → delezione dei segmenti terminali, i frammenti poi si associano dall’altra parte del cromosoma, il network cellulare che non lo riconosce come pericoloso perché non si creano dei frammenti liberi. Ricordiamo che la tossicità genica è sub-citotossica, quindi la cellula continua a mantenere la sua capacità replicativa; quindi, alla successiva replicazione cellulare viene perso il frammento acentrico. Se si ha un meccanismo di rottura e un riarrangiamento di questo tipo si può portare all’attivazione di geni, che in genere sono silenziati, o si può portare al silenziamento di geni espressi. Se sono interessati frammenti non codificanti. Questi meccanismi possono interessare anche due o tre cromosomi, per esempio si osserva il dicentrico, dove entrambi i cromosomi hanno avuto la delezione delle parti terminali delle braccia cromatidiche e i due cromosomi rimanenti si sono uniti a formare una struttura con due centromeri. Radiazioni ionizzate possono provocare cromosomi dicentrici (quantificati nelle popolazioni colpite da bomba atomica negli studi).

Mutazioni genomiche

Ultimo tipo di mutazione è quella che riguarda il numero dei cromosomi. Noi siamo un normale genoma diploide, di cui ne abbiamo 22 più i cromosomi sessuali. La poliploidia è un numero esagerato di cromosomi n diverso da 2. La trisomia è un caso di aneuploidia che riguarda malattia genetica, come per esempio la sindrome di Down. L’aneuploidia è la perdita o acquisizione di un cromosoma. Questo meccanismo non è una mutazione, perché non cambia la struttura del DNA.

Qual è un meccanismo che può sottendere l’aneuploidia? Un’alterata disgiunzione cromosomica, a seguito di un’esposizione non avviene perché si ha un’alterazione a livello della struttura del DNA ma mi sottende meccanismi diversi, che vedono o alterazione a livello della struttura del fuso mitotico, o delle alterazioni a livello delle proteine centromeriche. È un meccanismo sempre acuto ma dose-dipendente perché non interessa la struttura primaria del DNA.

Le mutazioni

La mutazione non è già il danno genetico ma è una interazione primaria con il target, mentre il danno è l’espressione della reazione primaria nel contesto dell’organo o tessuto, è quindi possibile avere mutazione ma non avere alcun danno.

L’evoluzione da mutazione a danno presuppone una serie di condizioni e diversi passaggi che devono verificarsi:

• Concentrazione nell’ambiente: se aumenta la concentrazione nell’ambiente aumenta la probabilità che l’evento si verifichi non si ha una linearità dose-risposta quindi qualsiasi dose può dare l’effetto.
• Ingresso e distribuzione nell’organismo: è necessario che sia distribuito ai diversi organi e apparati a livello dei quali esprimerà il suo effetto.
• Capacità metabolizzante va a conferire la reattività chimica fondamentale e necessaria ai pre-mutageni per l’induzione dell’effetto. La maggior parte delle sostanze è in infatti in forma pre-tossica e devono essere attivati e l’azione svolta da enzimi farmaco-metabolizzanti.
• Reattività del composto chimico e/o dei suoi metaboliti con i bersagli cellulari, soprattutto con il DNA: l’ultimo tossico nella sua concentrazione critica raggiunge il target con formazione di un legame covalente.
• Capacità della cellula di riparare o amplificare il danno.
• Opportunità di espressione del danno genetico: lo xenobiotico induce quindi una mutazione, che ancora non è il danno genetico la mutazione deve avere la possibilità di esprimersi a livello tissutale ed evitare ulteriori meccanismi difensivi molti dei quali su base immunologica.
• Abilità del tessuto di riconoscere e sopprimere la moltiplicazione di cellule con proprietà aberranti che possono essere individuate dal sistema immunitario.

Riassumendo

L’esposizione non è sufficiente ad avere una mutazione ma è un condizionante. La mutazione è il risultato della formazione di un legame stabile e irreversibile la struttura primaria del DNA e il mutageno e devono avvenire tutti i 7 passaggi perché l’esposizione porti a una mutazione. Il danno genetico è espressione della mutazione nel contesto biologico.

Meccanismo probabilistico

Si inizia con un pre-tossico che grazie al metabolismo può dare origine all’ultimo mutageno ma anche a metaboliti inattivi (detossificazione) oppure si possono formare intermedi (metaboliti prossimali) che possono essere anche questi detossificati. Inoltre, l’ultimo tossico si può legare con altre strutture della cellula che non sono DNA (es. lipidi, proteine…) formando dei legami non critici, andando così a diminuire la concentrazione disponibile libera. L’ultimo mutageno una volta formato può avere emivita molto breve.

Una volta avvenuta l’interazione tra mutageno e DNA si forma l’addotto ovvero è il prodotto di addizione tra xenobiotico e DNA, con formazione di un legame covalente dove la funzione nucleofila è situata sul DNA e la funzione elettrofila sul mutageno, questa è la lesione pre-mutazionale e non è ancora la mutazione, è la reazione primaria.

Si aprono nuovamente 3 possibilità:

1. Se il network molecolare riconosce la lesione a livello del DNA come critica, agisce sulla transizione cellulare G1-S, rallentando quella fase del ciclo cellulare attivando i sistemi di riparazione del DNA che intervengono, se avviene efficacemente portano al ripristino dell’integrità strutturale del DNA.
2. Se la lesione pre-mutazionale viene riconosciuta come una situazione che non è possibile riparare p53 attiva il meccanismo di apoptosi.
3. Quando il network molecolare non funziona o non riconosce oppure la cellula è vicina alla fase replicativa, quindi non vi è tempo per i vari processamenti la cellula si replica, ed è la replicazione cellulare il punto biologico di non ritorno dove la lesione viene fissata a mutazione e da questo punto in poi la cellula ha acquisito un genoma alterato e non potrà mai tornare a cellula normale e resterà tale per tutta la sua vita oppure potrà procedere fino al espressione del danno fino alla cancerogenesi.

Quindi la cellula può andare incontro a destini diversi e dipende dalla competenza metabolica, competenza di riparazione DNA e competenza di svolgere l’apoptosi ma sono caratterizzati da suscettibilità individuale (ognuno reagisce in maniera diversa al mutageno). La capacità di espressione della cellula mutata dipende dalla funzione della proteina interessata dall’alterazione.

Se la sequenza non è codificante non si hanno conseguenze patologiche, ma si ha comunque un’alterazione genomica, quindi la cellula acquisisce una certa instabilità genetica che la renderà più vulnerabile, a un’esposizione successiva il danno verrà favorito, cellula è più prona ad accusare un danno successivo.

Meccanismi di riparazione

Singolo passaggio

Il meccanismo di riparazione a singolo passaggio più comune, che viene esercitato ogni giorno, poiché interviene nella riparazione continua della lesione molecolare associata alle radiazioni non ionizzanti (luce UV, luce solare) formando legami tra due timine adiacenti, impedendo la replicazione corretta dando origine a una lesione, viene attivato anche l’enzima fotoliasi in grado di rompere i legami formati tra gli anelli pirimidinici.

Multi passaggio

I meccanismi di escissione sono efficacissimi e permettono l’individuazione anche di una singola base modificata o del singolo nucleotide modificato. Il meccanismo ha una fase di ricognizione poi individuato l’errore e con ausilio di enzimi specifici taglia (escissione) il frammento alterato e in seguito avviene la neo-sintesi del DNA su base semi-conservativa per cui un filamento fa da stampo all’altro, gli enzimi ligasi cuciono il segmento. Se tutto ciò funziona nella fase pre-replicativa, si ha il ripristino perfetto dell’integrità strutturale del DNA.

Alcuni degli enzimi coinvolti sono costitutivi esistono in un numero fisso quindi, in grado di riparare un numero fisso di lesioni e sono di norma privi di errore. Altri enzimi sono invece inducibili (non tutti lo sono) a seguito di esposizione ripetuta, come risposta adattativa, aumentano i loro livelli di attività attraverso sintesi ex-novo. Questo richiede delle settimane. Di norma sono enzimi inclini all’errore. Possono anche accadere errori molto più importanti nelle loro sintesi ex-novo, rispetto a quello per cui era stato attivato.

L’esposizione influenza l’efficienza riparativa dei sistemi di riparazione del DNA:

• Esposizione a basse dosi: intervengono gli enzimi costitutivi privi di errori, quindi senza nessun tipo di conseguenza.
• Esposizione ripetuta: si ha l’intervento degli enzimi costitutivi che però si saturano e si attiva la risposta adattativa e l’induzione enzimatica, la riparazione avviene con il rischio di non essere perfetta poiché gli enzimi inducibili sono inclini all’errore.
• Esposizione acuta, ad alte dosi: si ha la saturazione degli enzimi costitutivi (si saturano ad alte dosi) e non si hanno le condizioni che possono permettere l’attivazione di enzimi inducibili, il tutto porta alla condizione peggiore.

Riassumendo

L’esposizione è un forte condizionante non solo perché aumentandola si ha un aumento della probabilità che qualsiasi evento si verifichi ma può portare verso una diramazione piuttosto che l’altra del grafico. Si ha un’esposizione chimica nei confronti di un agente pre-mutageno che attraverso la biocinetica viene distribuito ad un organo e ad un tessuto raggiunge la concentrazione molecolare critica nella forma di ultimo mutageno ed interagisce con il target (DNA) instaura lesione pre-mutazionale che può essere riparata efficacemente portando al ripristino o non riparata o riparata in modo errato. Se la lesione è importante si può avere la morte della cellula. Se il danno non viene riparato e si ha duplicazione cellulare si fissa la mutazione (aberrazione cromosomica).

Classificazione degli xenobiotici

La classificazione degli xenobiotici più comune, li divide in 2 categorie (il discriminante è il meccanismo d’azione primario):

• Agente genotossico: composto, o suo metabolita, la cui azione biologica primaria è un’interazione diretta con la struttura primaria del DNA.
• Agente non genotossico: composto, o suo metabolita, privo di attività genotossica e l’evento biologico primario non prevede l’interazione diretta con il DNA.

Agenti genotossici

Sono presenti test di identificazione di un genotossico ma più semplicemente sono tutte le molecole che a seguito di un’ossidazione o di un'altra reazione sono in grado di portare un gruppo elettrofilo o radicalico quindi gruppi molto reattivi. Sono molecole che portano, ad esempio, a strutture con uno ione carbonio, un radicale libero, un epossido, uno ione episulfone, un lattone; sono genotossici gli idrocarburi policiclici aromatici, le aflatossine (sostanze estremamente potenti di origine naturale), alcuni alcheni, gli ioni carbonio e nitrenio, le ammine aromatiche ed eterocicliche, le acetammidi, i nitro-composti, gli alo-alcani, nitroso composti, le idrazine, mostarde azotate.

Cancerogenesi

Si tratta di un evento cronico, probabilistico, multifattoriale e multistadio. Da un punto di vista identificativo è un evento cronico, mentre la tossicità genetica è un evento acuto (si può verificare a seguito di una singola esposizione). Sono quindi necessarie esposizioni ripetute affinché si verifichi il fenomeno. Si hanno una serie di fattori che possono incidere significativamente sull’esordio e il proseguo della malattia. La predisposizione genetica può essere un fattore determinante come la storia riproduttiva o patologica. Il più forte determinante è l’alterazione dell’espressione genica acquisita, come i geni si esprimono dipende dallo stile di vita dell’individuo in cui due determinanti sono l’esposizione ambientale e la dieta.

La cancerogenesi è un evento multistadio:

• Iniziazione: è un meccanismo acuto (tossicità acuta, basta una singola esposizione per iniziare la cellula), irreversibile (una volta che la cellula è iniziata non potrà mai tornare alla condizione della cellula normale) ed è probabilistico. Dal punto di vista meccanicistico l’iniziazione è sovrapponibile alla mutagenizzazione, la differenza è il target genico interessato. L’iniziazione comporta sempre l’acquisizione di una mutazione a livello di geni sensibili ovvero protoncogeni o geni oncosoppressori. L’iniziazione conferisce capacità mitotica, permette quindi alla cellula di riprodursi in maniera autonoma nell’ambito della regolazione omeostatica (diventa un elemento mitoticamente attivo nell’ambito dell’omeostasi); parliamo di un meccanismo acuto che può necessitare giorni, settimane al max un mese. La cellula può rimanere anche in uno stadio statico di non divisione se non trova delle condizioni che ne permettano l’espressione del nuovo genotipo, oppure può avere accusato delle mutazioni incompatibili con la vita cellulare e può essere ancora mandata in apoptosi (post-replicativa in questo caso) oppure la cellula iniziata può iniziare a replicarsi i