Spettroscopia di fluorescenza molecolare
La fluorescenza è un processo di fotoluminescenza molto importante dal punto di vista analitico in cui gli atomi o le molecole vengono eccitate mediante assorbimento di radiazione elettromagnetica.
La transizione coinvolta nel processo di eccitazione è solo quella elettronica, quindi solo radiazioni dell’UV/Vis sono impiegabili per ottenere fenomeni di fluorescenza (no IR).
Le specie eccitate ritornano al loro stato fondamentale emettendo l’energia in eccesso sotto forma di fotoni.
Vantaggi e svantaggi dei metodi di fluorescenza
- Grande sensibilità; da uno a tre ordini di grandezza migliore di quella offerta dalla spettroscopia di assorbimento;
- Elevato intervallo di linearità; significativamente superiore a quello della spettroscopia di assorbimento;
- Meno largamente applicabili rispetto ai metodi di assorbimento per il ridotto numero di sistemi chimici in grado di dare fluorescenza.
Teoria della fluorescenza molecolare
La figura è una raffigurazione schematica parziale della distribuzione di energia per una specie molecolare ipotetica.
Con E0 esprimiamo lo stato fondamentale, mentre E1 e E2 sono gli stati elettronici eccitati. A ciascuno degli stati elettronici sono associati quattro stati eccitati vibrazionali.
Per convenzione lo stato eccitato E1 viene raggiunto da radiazioni del Vis, mentre lo stato eccitato E2 con radiazioni dell’UV.
L’irradiazione della specie E0 mediante una banda di radiazione di lunghezze d’onda da λ1 a λ5 (Vis) origina un momentaneo popolamento dei cinque livelli vibrazionali del primo stato eccitato E1.
Quando le molecole sono irradiate da una banda di radiazione più energetica, costituita da lunghezze d’onda più piccole da λ’1 a λ’5 (UV), risultano popolati rapidamente i cinque livelli vibrazionali dello stato energetico più elevato E2.
Il tempo di vita di una specie eccitata è molto breve poiché sono numerosi i modi con cui una molecola o un atomo eccitato può perdere l’energia assorbita e rilassarsi sino al proprio stato fondamentale.
Due meccanismi importanti di questo tipo di processo sono:
- Rilassamento non radiativo
- Rilassamento fluorescente
Rilassamento non radiativo
La disattivazione o rilassamento vibrazionale tra i livelli di energia vibrazionale avviene durante le collisioni tra le molecole eccitate e le molecole del solvente.
L’energia vibrazionale eccedente viene trasferita alle molecole del solvente.
La vita media di uno stato vibrazionale eccitato è solo di 10-15 sec.
Un secondo tipo di rilassamento non radiativo è detto conversione interna ed avviene tra il livello vibrazionale più basso di uno stato elettronico eccitato E1 e quello più alto di un altro stato elettronico.
Questo processo è molto meno efficiente del rilassamento vibrazionale, con una vita media dello stato eccitato tra i 10-6 e i 10-9 sec.
Rilassamento fluorescente
Come è mostrato in figura (c), quando le molecole diventano fluorescenti vengono prodotte bande di radiazioni poiché le molecole eccitate elettronicamente possono subire un processo di rilassamento verso uno qualsiasi dei numerosi stati vibrazionali dello stato elettronico fondamentale.
Linee di risonanza e spostamenti di Stokes
Le linee con cui terminano le due bande di fluorescenza a lunghezza d’onda più piccola, quindi a più alta energia, (λ1 e λ’1) (c) sono identiche in energia alle due linee indicate da λ1 e λ’1 nello schema di assorbimento della figura (a).
Queste linee sono dette linee di risonanza in quanto le lunghezze d’onda dell’assorbimento e della fluorescenza sono identiche.
Le bande di fluorescenza molecolare sono costituite soprattutto da linee con λ maggiori delle bande di radiazione assorbite responsabili del loro eccitamento, e quindi con minore energia.
Questo fenomeno è chiamato spostamento di Stokes.
Relazione tra gli spettri di eccitazione e gli spettri di fluorescenza
Le differenze tra gli stati vibrazionali sono simili sia per lo stato fondamentale che per quelli eccitati, per cui l’assorbimento o spettro di eccitazione
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