Schemi, mappe e spiegazioni di Metodologie genetiche e biomolecolari

Metodologie biomolecolari e genetiche

Lezione 1 – 05/10/2022

Clonare significa prendere un frammento di DNA e inserirlo in un vettore. Vettori sono un DNA plasmidico o plasmide o costrutto, circolare a doppio filamento.

Cenni storici

Dall'inizio del secolo scorso (1903 Sutton e 1910 Morgan) si è scoperto che i geni risiedono sui cromosomi. Dal 1950 circa si è studiato che il DNA rappresenta il materiale genetico e la sua mappatura (mappe fisiche e genetiche) e dal '50 al '60 si è studiata la struttura del DNA, il codice genetico e i vari processi di trascrizione e traduzione. Negli anni '60 la strumentazione non permetteva uno studio più dettagliato dei geni. Si sapeva che il materiale genetico venisse ereditato ma le tecniche non erano ancora state scoperte. Anni '70 rivoluzione della biologia sperimentale (genetica sperimentale). Le nuove tecnologie hanno permesso di progettare esperimenti prima impensabili. Queste tecnologie sono tecnologie del DNA ricombinante e/o di ingegneria genetica. È ciò di cui ci occuperemo noi!

Laboratorio e tecniche

In laboratorio prenderemo due vettori con all’interno un frammento di DNA codificante, quindi un gene, un promotore ed un terminatore. Prendiamo questi vettori/plasmidi/costrutti. Uno lo useremo per trasformare una pianta in una pianta transgenica in laboratorio e un altro lo usiamo per trasformare il lievito (organismo modello per studiare gli eucarioti). Faremo anche degli esperimenti di mutagenesi, ossia un gene che inseriamo nel vettore e creiamo una mutazione in un punto specifico. Useremo poi il vettore che contiene il gene wild-type confrontandolo con quello mutato e vedremo che il mutato non funziona a differenza di quello wild-type che funziona.

Perché manipoliamo il DNA? Per capire la funzione di una proteina, di una cellula, di un tessuto e in definitiva di un organismo. Vogliamo capire la funzione di tutti i geni e quindi di tutte le proteine e delle varie interazioni tra le proteine. Inoltre per trovare soluzioni a problemi: proteina mal funzionante (non si esprime quando dovrebbe), non funzionante (non funziona), e ciò causa una crescita anomala di una cellula ecc.

Dogma della biologia: DNA → RNA → proteine. Anche se con le nuove scoperte si è visto che non è proprio così: anche l’RNA può svolgere altre funzioni.

Premi Nobel e scoperte

• John B. Gurdon: ha eliminato il nucleo di una cellula di rana (nucleato una cellula) e lo ha sostituito con quello di una cellula presa da un girino, il quale si è sviluppato in un normale girino; stadio diverso dello sviluppo.
• Shinya Yamanaka: ha studiato i geni importanti per la funzione delle cellule staminali, ne ha permesso l’identificazione, poi l’isolamento e la produzione di quei geni in modo esponenziale (amplificazione) e clonato in un vettore (dove è stabile) per poi utilizzarlo per i vari esperimenti. Quando questi geni venivano trasferiti in cellule dall’epidermide, queste venivano riprogrammate a diventare delle cellule staminali pluripotenti. Le cellule staminali possono differenziarsi in diversi tessuti. Ma inserire dei geni in cellule dell’epidermide e vedere l’espressione di questi geni e convertire le cellule dell’epidermide in cellule con un’altra funzione è stata una scoperta fondamentale per la biologia molecolare.

Hanno visto che le cellule staminali potevano svilupparsi in altri tipi di cellule nel topo adulto. Queste sono dette induced pluripotent stem cells iPS. Le iPS possono essere prodotte nel paziente che ha una certa patologia e poi differenziare queste cellule in tessuti e organi diversi. Studio e guarigione di patologie.

Clonaggio e biotecnologie

È possibile clonare un gene: lo possiamo sequenziare, lo possiamo amplificare (PCR [ne conosco la sequenza e ne posso disegnare dei primer] o tramite vettori di clonaggio batterici) e lo possiamo frammentare. Abbiamo la possibilità di studiare i singoli geni e di studiare la loro funzione, grazie alle biotecnologie. Ad esempio possiamo produrre l’insulina preparando un costrutto mettendolo all’interno del DNA che codifica per l’insulina e facendo sì che questo si moltiplichi poi estraggo la proteina di interesse. Tutto in vitro.

• Per essere studiato il DNA deve essere purificabile e amplificabile.
• Si può fare utilizzando batteri in laboratorio (E. Coli o lievito).
• Il DNA (o un frammento del DNA) deve essere mantenuto all’interno di un vettore.
• Esistono vari tipi di vettori (plasmidi, fagi, cosmidi BAC, YAC ecc.) i più usati sono i PLASMIDI.

Posso anche non sapere sempre la funzione di tutti i geni/frammenti di DNA.

Vettori plasmidici

I vettori plasmidici sono molecole di DNA circolari ed extracromosomiche che vivono indipendentemente all’interno della cellula batterica (li possiamo trovare anche in alcuni eucarioti unicellulari come i lieviti, ma non eucarioti superiori). Conferiscono caratteristiche utili al batterio, es. la capacità di sopravvivere a concentrazioni tossiche di antibiotici (antibiotico resistenza) o ad altre sostanze come toluene, idrocarburi, ecc. I batteri si riproducono così velocemente rispetto all’uomo che evolvono anche più rapidamente. In natura i plasmidi possono avere dimensioni variabili da 1,0 Kb a più di 250 Kb.

Numero di copie: il numero di molecole di un singolo plasmide che si trovano normalmente in una sola cellula batterica (uno, low copy number, fino a 50 copie, high copy number). Per replicarsi all’interno dei batteri i plasmidi necessitano della sequenza ORI (origine di replicazione del batterico). È necessario un polylinker o MCS (multiple cloning site), sito lungo (è un frammento) di apertura del vettore che rende il vettore linearizzato e non più circolare. Inoltre c’è un gene (lacZ) che permette di distinguere il plasmide circolare da quello con il frammento di DNA al suo interno. E poi ovviamente una resistenza ad un antibiotico o una resistenza a determinate sostanze. Esempio di plasmide artificiale usato in laboratorio pUC19 (plasmide, University of California, n.19) con 2686 bp.

Trasformazione batterica: in natura è un evento raro di scambio di materiale genetico tra batteri, ma le tecniche oggi a disposizione ci permettono di aumentare l’efficienza della trasformazione (far sì che le cellule batteriche prendano al loro interno il plasmide). Ovviamente attraverso uno shock termico o elettrico. È necessario selezionare i batteri trasformati (con DNA ricombinante) dai non trasformati. Si utilizza un gene che codifica per la resistenza ad un antibiotico (marcatore di selezione). Nelle piastre petri devo fare la selezione inserendo l’antibiotico così cresceranno (37°C) solo le cellule resistenti all’antibiotico. Se no si forma una patina di colonie.

Plasmidi utilizzati in laboratorio: in laboratorio la resistenza ad un antibiotico viene spesso utilizzata come marcatore di selezione per assicurarsi che i batteri di una coltura contengano un particolare plasmide. Più contiene resistenze più deve essere grande il plasmide (più frammenti). Affinché il plasmide possa entrare nelle cellule batteriche (TRASFORMAZIONE) queste devono essere trattate, rese permeabili. Si dice che le cellule devono essere COMPETENTI. In lab. le cellule sono rese competenti con un trattamento con CaCl o MgCl e freddo (in ghiaccio). La presenza del calcio da resistenza alle membrane. CaCl o MgCl e freddo agiscono sulla struttura e permeabilità della parete e membrana cellulare e permettono il passaggio del DNA. Il trattamento rende le cellule molto fragili e devono essere trattate con attenzione!

Inserimento di DNA

Come si inserisce un frammento di DNA di interesse?

1. Utilizzando gli enzimi di restrizione che spezzano il DNA rompendo il legame tra OH al 3’ ed il P al 5’. Gli enzimi di restrizione sono stati identificati da cellule batteriche. Essi sono altamente specifici. Tagliano le estremità in specifiche sequenze rendendo le estremità piatte (blunt end) o con una protuberanza (sticky end). Scoprire che potevano essere utilizzati questi enzimi ha permesso l’apertura delle tecniche di DNA ricombinante. Es. HindIII e KpnI (sticky end). Si utilizzano enzimi di restrizione diversi (una coppia solitamente) per poi l’inserimento nella giusta direzione. I vettori contengono sequenze con molti siti di restrizione: MCS o Polylinker. Quindi si deve tagliare il DNA di interesse al di fuori della sequenza (devo clonare tutta la sequenza necessaria, non solo un pezzo). Poi si clona questo pezzo di DNA all’interno del vettore, si fa un trattamento con un enzima, DNA ligasi, che permette di legare il frammento all’interno del vettore. Ottengo così il vettore ricombinante che contiene il gene di interesse. Amplifico il plasmide e quindi anche il gene che contiene. Dopo lo purifico, ossia separo il gene da tutte le proteine di E.Coli. Il polylinker è una sequenza che contiene tanti siti di restrizione ed esistono in commercio tanti plasmidi che hanno un polylinker o MCS leggermente diverso.

NB Devo selezionare i batteri che contengono i ricombinanti, ossia i plasmidi che contengono l’inserto (frammento di DNA) [non chiuso circolarizzato]. Perciò si utilizza Lacz, che codifica per una parte dell’enzima β-galattosidasi. Il clonaggio di un frammento di DNA porta all’inattivazione del gene lacZ’. Quindi i ricombinanti vengono identificati in base alla loro incapacità di sintetizzare l’enzima β-galattosidasi. Lo screening in realtà è facile, non si saggia il taglio del lattosio in glucosio e galattosio, ma semplicemente utilizzo delle sostanze che mi danno delle indicazioni. Si sfrutta una reazione anch’essa catalizzata dalla β-galattosidasi. Utilizza come substrato un analogo del lattosio detto X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside) che viene degradato dalla β-galattosidasi in un prodotto intensamente colorato di blu. Aggiungendo all’agar: LB + l’antibiotico per selezionare le cellule trasformate x-gal + un’induttore dell’enzima (IPTG) per selezionare i ricombinanti. Avremo tutte cellule trasformate (avendo usato un terreno selettivo) ma le cellule trasformate non ricombinanti produrranno la β-galattosidasi e saranno blu; mentre le cellule ricombinanti saranno bianche. I 2 screening vengono fatti in un’unica piastra (ricombinate e trasformate).

Clonaggio blunt end

Il vettore viene linearizzato con enzimi di restrizione che producono un blunt end. È versatile perché non ci sono limitazioni di sequenza. È 10-100 meno efficiente del clonaggio con estremità coesive ed il 50% delle colonie ricombinanti hanno l’orientamento sbagliato. È necessario usare due enzimi di restrizione diversi per avere la corretta direzionalità. Altro problema è che il vettore può ricircolarizzare quindi avremo colonie con il vettore vuoto quindi è necessario defosforilare il DNA plasmidico (tolgo il fosfato al 5’) e fare una ligazione (inserisco il frammento di interesse). È necessario fare uno screening delle colonie.

2. Fare un clonaggio di frammento di PCR. Aggiungendo siti di restrizione alle estremità del DNA amplificato per clonaggio direzionale. Molti enzimi di restrizione non riconoscono il sito se localizzato all’estremità del primer. Gli enzimi di restrizione per funzionare devono appoggiarsi sulla sequenza del primer più lunga. Poi taglia in modo specifico. Ma non si appoggia se non c’è niente su cui appoggiarsi. Utilizzo la PCR ma utilizzo anche gli enzimi di restrizione e ottengo il frammento che voglio clonare.

2.1-> Clonaggio di un frammento di PCR tramite T/A-cloning uso vettori pGEM. Prendono il nome dalla presenza di una T sporgente (protruding) aggiunta al plasmide linearizzato, sono compatibili per la ligazione con un frammento PCR con A terminale protruding (utilizzando l’enzima Taq polimerasi). Questi 3’ T migliorano l’efficienza di ligazione di un prodotto di PCR evitando la ricircolarizzazione del vettore (circa, perché ci sono comunque poche colonie blu). Il vantaggio è che ho un clonaggio rapido e non dipende da enzimi di restrizione; lo svantaggio è che non si esegue il clonaggio direzionale. Screening delle colonie bianche e blu (lacZ).

3. Il TOPO cloning: clonaggio mediato da DNA topoisomerasi I. Topo-TA cloning si avvantaggia del fatto che la TAQ polimerasi aggiunge una A protruding al 3’ del prodotto di PCR. Il vettore linearizzato ha una T protruding al 3’ e permette una facile ligazione del frammento di PCR (5 minuti a temperatura ambiente). Il vettore contiene una topoisomerasi I con un residuo Tyr legato al 3’P del vettore linearizzato e ciò previene la ricircolarizzazione del vettore e permette il legame del frammento di PCR. Si stabilisce il legame tra fosfato e OH (più forte del legame covalente) e scalza via la topoisomerasi e si chiude il vettore che è ricombinante, contiene il prodotto di PCR. L’enzima chiave del TOPO cloning è la DNA topoisomerasi I e non richiede ligasi (si chiude il vettore con l’inserto). Ruolo: tagliare e riattaccare il DNA durante la replicazione. La topoisomerasi I vaccina riconosce la sequenza 5’-(C/T)CCTT3’ e forma un legame covalente con il gruppo P al 3’ della timina. Il legame P-tyr tra il DNA del vettore e l’enzima viene attaccato dal 5’ OH dell’estremità del frammento di PCR e la topoisomerasi si stacca. Problema: la topoisomerasi non è proofreading.

Lezione 2 – 06/10/2022

Riassunto: quando vogliamo studiare il DNA, la funzione di un gene o capire che funzione ha quel particolare DNA, dobbiamo clonarlo in un vettore, purificarlo (ossia separarlo dal resto del DNA dell’ospite) e amplificarlo (avere una certa quantità per poter lavorare con questo DNA). Dobbiamo usare de vettori plasmidici (DNA circolare, di varie dimensioni, più piccoli più è efficiente il clonaggio). Il vettore o è circolarizzato (contiene quindi un polylinker o MCS). Uso la PCR e quindi devo conoscere la sequenza del frammento che voglio clonare, su quel frammento disegno un primer e poi in qualche modo con particolari vettori posso inserire il frammento amplificato con la PCR all’interno del vettore.

Posso amplificarlo con la PCR, o si possono aggiungere delle basi al primer (quindi primer più lungo) che possono essere riconosciute da degli enzimi (che riconoscono e tagliano); ottengo per PCR questo frammento, poi devo digerirlo, poi lo posso clonare. Siamo poi passati a considerare altri sistemi di clonaggio: vettore che ha T-protruding pGEM (viene venduto aperto con le T protruding e posso clonare al suo interno un frammento di PCR amplificato con la taq polimerasi che lascia le a protruding; ed è indipendente dall’utilizzo degli enzimi di restrizione) e infine topo TA cloning, estremità del vettore aperto che termina con CCCTT al cui P (di T) si lega un residuo della topoisomerasi I, non è necessario un tempo per la ligazione (basta lasciarlo 5 min a T ambiente e quindi in una mattina devo fare tutto il clonaggio). Trasferiamo all’interno di un microrganismo (trasformazione) per tutta la notte; e dalle cellule di Coli estraggo il frammento di DNA di interesse. Bisogna essere sicuri che si stia studiando il frammento di DNA corretto.

High fidelity è un’altra polimerasi che è in commercio ed ha attività proofreading [taq polimerasi invece no]. Altra possibilità è l’uso del vettore indicato sotto “Zero Blunt TOPO vector”, che consente il clonaggio di un prodotto di PCR blunt-end. Uso high fidelity (che non lascia le A protruding) e lo si clona nel vettore B che ha le estremità piatte. C’è sempre la topoisomerasi legata al T-terminale, ma alle estremità piatte e quindi consente di clonare un frammento di PCR che ho amplificato con una polimerasi (enzima) proofreading [high fidelity, golden taq e altre]. Hanno però questi due vettori un problema, ossia che non permettono il clonaggio unidirezionale perché il frammento si può inserire in un verso o nell’altro. Quindi ho sempre il 50% di possibilità che si inserisca nel verso corretto.

Un’altra possibilità è usare il vettore A, posso ovviare al fatto che la taq rilasci degli errori, utilizzando una miscela di TAQ polimerasi e high fidelity. Oppure posso usare il vettore B che lascia le estremità piatte (blunt-end) però posso usare anche la high fidelity per l’amplificazione (che mi lascia le estremità piatte) aggiungendo nelle ultime reazioni il tailing (aggiungo tail), ossia aggiungo le A. quindi posso a fine reazione di PCR aggiungere le A-protruding (fare operazione di tailing). In questo modo uso high-fidelity quindi non ho errori convertendolo con il tailing.

D-TOPO

Sistema TOPO. C’è sempre la topoisomerasi legata al fosforo del P, però c’è un protruding GTGG che non c’era nel vettore precedente. Faccio un prodotto di PCR utilizzando i primer che servono per amplificare il frammento di interesse dove però ad uno dei due primer aggiungo le basi CACC (complementari a GTGG). In questo modo amplifico un frammento di PCR con una polimerasi che è proofreading, e se aggiungo queste basi ho la certezza di ottenere il prodotto nella giusta direzione. Perché se aggiungo le basi a una delle due estremità succede la reazione di separazione dei due estremi e si ha la formazione del frammento complementare. Si inserisce nella giusta direzione, la topoisomerasi viene rilasciata (si stacca) e la ligazione è completa. Quindi con questi tre vettori diversi possiamo clonare il frammento di PCR. In questo modo ho un clonaggio unidirezionale: il prodotto di PCR viene amplificato con 1 dei 2 primer con.