Replicazione del DNA e meccanismi di riparazione di errori

Replicazione del DNA

Prima di entrare nel merito del processo di replicazione del DNA, è bene esaminare a priori la struttura del DNA e le finalità per le quali avviene tale processo di duplicazione genomica. In Interfase G1, normalmente, la cellula dispone di un corredo cromosomico monocromatidico, perché reduce del processo di biogenesi. In Interfase S, una volta superato il G1/S checkpoint, la cellula è pronta ad avviare l'attività replicativa del DNA finalizzata per lo più alla corretta redistribuzione del materiale genetico alle cellule figlie, che dovranno disporre, nel caso della mitosi, di un genoma quantitativamente e qualitativamente identico a quella della cellula di partenza. È in interfase S che i cromosomi da essere monocromatidici diventano dicromatidici.

La struttura del DNA è stata resa nota nell'Aprile del 1953, più precisamente il 25 Aprile del 1953, quando James Watson e Francis Crick pubblicarono su Nature un articolo che riportava tutte le peculiarità della macromolecola.

• Il DNA è un grande polimero a doppio filamento, nel quale l'impalcatura madre è rappresentata da due filamenti polinucleotidici ai quali è associato un momento rotazionale destrogiro.
• Ogni filamento è un polimero a livello del quale il monomero è rappresentato dalla struttura nucleotidica; a livello dei singoli nucleotidi, senza eccezioni, sono individuabili tre fondamentali componenti: un furanosio, cioè un pentoso ciclico a cinque atomi di carbonio, un fosfato inorganico ed una base azotata.
• Il pentoso è una molecola glucidica ciclica, un desossiribosio, che a livello del secondo atomo di carbonio lega a sé due atomi di idrogeno, a differenza della controparte ribonucleica nella quale lo zucchero, il ribosio, lega a sé un atomo di idrogeno ed una funzione ossidrilica -OH. Il gruppo fosfato ha un ruolo centrale nella formazione del legame internucleotidico; esso, in associazione al desossiribosio, costituisce l'intelaiatura fondamentale del DNA. In ultima analisi le basi azotate, purine e pirimidine, fra le quali intercorre un rapporto di complementarietà. Le purine, che comprendono adenina e guanina, sono dei composti a doppio anello, nei quali uno è pentatomico e l'altro invece esatomico, le pirimidine, che comprendono timina, guanina ed uracile (nell'RNA), sono invece composti a singolo anello, esatomico.
• Considerando le varie interazioni di carattere chimico, in prima istanza è bene ricordare la natura del legame internucleotidico; esso viene definito fosfodiesterico. La formazione del legame fosfodiesterico prevede che la funzione ossidrilica dell'ortofosfato del nucleotide in aggiunta interagisca, tramite reazione di condensazione, con la funzione idrossilica in posizione 3 del pentoso. La formazione di tale legame determina la perdita di una molecola d'acqua. Ogni nucleotide in aggiunta non dispone di un solo fosfato inorganico, bensì di tre: dATP, dGTP, dCTP e dTTP. I deossinucleosidi trifosfato sono fondamentali poiché la scissione dei due legami fosfoanidridici che intercorrono tra il fosfato alfa e beta, concede l'energia necessaria alla formazione del legame. Questo implica che la polimerizzazione di un filamento polinucleotidico rappresenti un processo endoergonico. Le basi azotate si legano al furanosio in corrispondenza del carbonio 1 dello stesso, tramite un legame N-glicosidico. Le basi azotate, nel loro insieme, interagiscono secondo le regole della complementarietà di Cargaff, istituendo delle interazioni deboli ad idrogeno.
• La cristallografia della Franklin, eseguita negli anni '40, ha messo in luce un'altra importante caratteristica. Le basi azotate sono delle molecole planari che, a livello del core idrofobo del DNA, vanno impilandosi l'una sull'altra con un passo di 0.34 nm. La loro disposizione prevede che assumano una posizione perpendicolare all'asse di rotazione della molecola. Per ogni passo di 0.34 nm, quindi per ogni coppia di nucleotidi, la molecola compie un giro di 36°. Ogni 10 nucleotidi, il DNA effettua una rotazione completa di 360°.

Le caratteristiche del DNA (in particolare la transitorietà dei legami a idrogeno tra le basi azotate) hanno portato la comunità scientifica, molti anni fa, a supporre che nella cellula esistessero dei meccanismi tramite i quali il genoma potesse autoreplicarsi. Per questo andarono diffondendosi tre diversi modelli di spiegazione del processo replicativo:

• Modello conservativo: secondo il modello conservativo, l'intera molecola di DNA funge da stampo per una molecola di nuova sintesi. A conclusione della replicazione si hanno una molecola parentale ed una di recente produzione.
• Modello semiconservativo: secondo il modello semiconservativo, ogni filamento della molecola di DNA funge da stampo per un nuovo scheletro polinucleotidico. Le due molecole risultanti possiedono un filamento appartenente alla molecola di DNA d'origine ed un filamento neo-sintetizzato.
• Modello dispersivo: secondo il modello dispersivo, nel corso della replicazione, ogni filamento del DNA viene replicato ma a tratti, facendo sì che le molecole finali abbiano dei filamenti nei quali sono presenti tratti del DNA parentale e tratti di DNA neo-sintetizzato.

Esperimento di Meselson e Stahl

Per la dimostrazione del modello semiconservativo di replicazione del DNA, estremamente utile fu l'esperimento di Meselson e Stahl. I due ricercatori posero dei batteri Escherichia coli in una coltura contenente l'isotopo pesante dell'azoto, cioè l'N¹⁵. Quindi i due si assicurarono che i batteri Escherichia coli interagissero a lungo tempo con l'isotopo, con la finalità di ottenere delle molecole di DNA nelle quali l'azoto pesante fosse stato incorporato per intero. Cioè l'obiettivo era ottenere una molecola di DNA nella quale ambedue i filamenti possedessero l'isotopo dell'azoto.

Successivamente i due sfruttarono la tecnica di centrifugazione in gradiente di densità tramite l'impiego del cloruro di cesio: una volta prelevati i campioni di DNA di interesse, essi vengono posti in una provetta contenente cloruro di cesio a densità crescente verso il fondo. Le molecole migrano in soluzione verso il fondo, fermandosi lì dove la soluzione ha una densità analoga a quella della molecola medesima. Inizialmente si osservò che i campioni si arrestavano in basso. Entrambi i filamenti di DNA hanno incorporato azoto pesante.

In seguito, i due posero i batteri in una coltura contenente l'isotopo leggero dell'azoto, l'N¹⁴, in maniera tale che le molecole di DNA potessero incorporarlo. Si osservò in seguito che i campioni di DNA, prelevati ad intervalli di tempo regolari e sottoposti a centrifugazione in gradiente di densità, andavano ad organizzarsi in una banda leggera sempre più marcata, con il progredire delle generazioni di DNA replicato.

Replicazione del DNA - passaggi e caratteristiche

La replicazione del DNA è un processo estremamente regolato e preciso, tant'è vero che il tasso di errore relativo ad un appaiamento sbagliato fra le basi azotate è pari a circa una ogni miliardo di basi. La complementarietà delle basi azotate è un meccanismo sì preciso, ma non così tanto: un appaiamento errato ogni 100 kbp. Questo dimostra che esistono altri complessi molecolari che mediano la replicazione.