Enzimologia, primo modulo Biochimica

Glicerofosfolipide o fosfogliceride

I fosfogliceroli rappresentano i lipidi di membrana più importanti; sono costituiti da una molecola di glicerolo esterificata in C1 e in C2 con due molecole di acidi grassi e in C3 con una molecola di acido fosforico. L’acido fosforico è a sua volta esterificato con un alcol.

I fosfogliceridi sono molecole anfipatiche: presentano una testa polare idrofila (acido fosforico) e una coda apolare idrofoba (acidi grassi). In ambiente acquoso vanno a formare un doppio strato: le teste polari si dispongono verso il solvente acquoso, mentre le code apolari si orientano coda contro coda all’interno della membrana.

• Glicerolo: il glicerolo è un polialcol (sostanza organica che presenta più di un gruppo alcolico OH), una molecola a tre atomi di carbonio che presenta tre gruppi alcolici.
• Acidi grassi: gli acidi grassi sono molecole composte da catene idrocarburiche di varia lunghezza e grado di insaturazione terminanti con un gruppo carbossilico.
• Acido fosforico: l'acido fosforico è un acido inorganico.

Legame estere

Un legame estere è definito come il legame tra un gruppo alcolico (-OH) e un gruppo acido carbossilico (-COOH), formato dall'eliminazione di una molecola d'acqua (H2O).

Gruppo carbossilico

Il gruppo carbossilico è formato dal gruppo carbonilico C=O, e dal gruppo ossidrilico -OH. Il gruppo carbossilico è il gruppo caratteristico degli acidi carbossilici.

Fosfolipasi A2 (PLA2)

La fosfolipasi A è un enzima in grado di idrolizzare il legame estere che tiene unito l’acido grasso in posizione 2 allo scheletro del fosfolipide (glicerolo). L’idrolisi di tale legame provoca il rilascio di acido arachidonico (precursore di tutta una serie di molecole responsabili dell'infiammazione) e lisofosfolipidi.

I lisofosfolipidi rimangono ancorati alla membrana attraverso una sola catena alifatica, non due come avviene per i glicerofosfolipidi.

Cobra

Il cobra per uccidere le sue prede inietta nel loro sangue una serie di tossine. Tra queste troviamo la fosfolipasi A (PLA2), un enzima in grado di danneggiare la membrana cellulare degli eritrociti. La membrana cellulare degli eritrociti contiene fosfolipidi. La fosfolipasi A media la rottura idrolitica del legame che tiene unito l'acido grasso in posizione 2 al glicerolo.

Gli acidi grassi che si liberano vanno a formare delle micelle (aggregati sovramolecolari di molecole anfipatiche) che sono in grado di estrarre i fosfolipidi dalla membrana. Questa è l’azione saponificante degli acidi grassi rilasciati dalla fosfolipasi A2. Quindi, non è soltanto l’azione della fosfolipasi A che reca un danno alla membrana, ma anche la presenza di grosse quantità di acidi grassi che si aggregano andando a formare micelle.

Il rilascio di grosse quantità di citoplasma di globuli rossi all'interno del plasma determina uno shock che porta alla morte dell’animale.

Anemia falciforme

L’anemia falciforme è una malattia ereditaria, così definita per la caratteristica forma a falce assunta, in particolari circostanze, dai globuli rossi del malato. L'anemia a cellule falciformi è dovuta ad una mutazione della subunità beta dell’emoglobina, che determina un cattivo ripiegamento della catena e, di conseguenza, una struttura quaternaria alterata. Questa, a sua volta, determina un cambiamento di interazione con le altre proteine di emoglobina e questo, in condizioni di bassa pressione di ossigeno, determina la formazione di fibre proteiche che vanno ad alterare la forma del globulo rosso, compromettendone la stabilità e la resistenza.

Normalmente i globuli rossi hanno una forma simile ad un disco, sono flessibili e scorrono facilmente anche attraverso i vasi sanguigni più piccoli. Nelle persone con anemia falciforme, invece, i globuli rossi hanno una forma insolita, a falce o a mezzaluna, sono appiccicosi e rigidi e, di conseguenza, rimangono intrappolati nei piccoli vasi sanguigni impedendo così al sangue di raggiungere tutte le parti del corpo. I globuli rossi delle persone malate di anemia falciforme sono più fragili di quelli delle persone sane, vivono di meno e questo determina una grave anemia.

Emoglobina -> proteina tetramerica formata da 2 subunità alfa e 2 subunità beta.

Enzimologia

L’enzimologia è il ramo della biochimica che studia gli enzimi.

Gli enzimi sono proteine dotate di attività catalitica.

La rete complessa di reazioni chimiche che si svolgono continuamente all'interno delle cellule è assicurata da un corredo di enzimi definito geneticamente da ogni cellula.

Cellule differenti presentano differenti corredi enzimatici.

Catalisi

La catalisi è un fenomeno chimico mediante il quale una sostanza, chiamata catalizzatore, influenza la velocità di una reazione chimica. Si parla di catalisi enzimatica nel momento in cui il catalizzatore è un enzima.

Catalizzatori

I catalizzatori sono sostanze che, aggiunte in piccole quantità, modificano il valore dalla velocità di una reazione abbassando o innalzando l’energia di attivazione. Queste sostanze non cambiano l’equilibrio della reazione e non vengono consumate dal procedere della reazione stessa. Ciò che cambia è semplicemente il meccanismo attraverso cui la reazione avviene e la velocità con cui si raggiunge l'equilibrio.

La maggior parte delle reazioni che avvengono nel corpo umano e nel corpo degli animali sono reazioni lente. Questo significa che i legami chimici che si devono rompere affinché le reazioni possano avvenire sono legami chimici cineticamente stabili (non si rompono alle temperature fisiologiche a cui si trovano gli organismi). I catalizzatori fanno sì che processi che avverrebbero molto lentamente (ad esempio anni) avvengano in tempi relativamente brevi (ad esempio secondi, minuti, o ore). Alcune reazioni, senza catalizzatore, potrebbero non avvenire mai o metterci secoli. Questo è il motivo per cui gli enzimi sono così importanti nella biologia cellulare.

Reazione chimica

Si definisce reazione chimica qualunque trasformazione di una o più sostanze, dette reagenti, in nuovi composti, chiamati prodotti, attraverso la rottura e la formazione di legami chimici. Una reazione chimica può essere rappresentata simbolicamente con un'equazione che ha nella parte sinistra i reagenti (A e B) e nella parte destra i prodotti (P e Q).

L'enzima non è né un substrato né un prodotto, quindi non compare nell’equazione stechiometrica di una reazione chimica.

Velocità di una reazione

La velocità di una reazione corrisponde alla variazione della concentrazione dei reagenti nel tempo (V= -ΔR/Δt -> il segno – rende la velocità una grandezza positiva). Al procedere della reazione la concentrazione dei reagenti diminuisce, mentre quella dei prodotti aumenta.

Equilibrio chimico

L'equilibrio chimico indica il punto finale di una reazione chimica, può essere statico o dinamico.

• L’equilibrio dinamico viene raggiunto quando la velocità diretta di una reazione (velocità con cui i reagenti si trasformano in prodotti) è uguale alla velocità inversa (velocità con cui i prodotti si trasformano in reagenti). L’equilibrio dinamico interessa le reazioni incomplete e reversibili.
• L’equilibrio statico viene raggiunto quando almeno uno dei reagenti è esaurito e la reazione cessa del tutto di verificarsi. L’equilibrio statico interessa le reazioni complete e irreversibili.

All’equilibrio la composizione chimica del sistema non varia più.

L'equilibrio chimico, dal punto di vista energetico, è una condizione non ottimale per le cellule, perché in queste condizioni la cellula non è più in grado di cambiare la composizione del suo ambiente cellulare.

Reazioni complete e incomplete

• Nelle reazioni complete all'equilibrio tutti i reagenti si trasformano in prodotti. Questo accade perché i reagenti sono molto più instabili rispetto ai prodotti dal punto di vista termodinamico.
• Nelle reazioni incomplete all’equilibrio soltanto una parte dei reagenti si trasforma in prodotti. La percentuale di reagenti che si trasformano in prodotti dipende dalla reazione e, in particolare, dalla stabilità relativa tra reagenti e prodotti. Ogni reazione ha il suo punto di equilibrio, quindi bisogna conoscere le sue caratteristiche termodinamiche per capire se una reazione è più spostata verso i prodotti o verso i reagenti.

Energia di attivazione

Secondo la teoria degli urti, affinché una reazione possa avvenire, le molecole dei reagenti devono urtarsi con energia sufficiente, oltre che con una corretta orientazione. Tale energia deve superare il valore dell’energia di attivazione, cioè l’energia minima necessaria per far avvenire una reazione. L'energia di attivazione della maggior parte delle reazioni che si svolgono nelle cellule è elevata. Gli enzimi sono in grado di abbassare l’energia di attivazione di tali reazioni. Se gli enzimi non sono presenti le reazioni non avvengono.

Stato di transizione

Il complesso attivato o stato di transizione è un intermedio che si forma durante la conversione dei reagenti in prodotti. Esso corrisponde al momento della reazione in cui i reagenti stanno rompendo i legami e, nello stesso tempo, si stanno formando i nuovi legami che permettono la formazione dei prodotti.

Nel diagramma dell’energia di reazione, il complesso attivato corrisponde al punto più alto della curva, dove l’energia potenziale è massima. Il diagramma dell’energia di reazione rappresenta l’andamento dell’energia potenziale del sistema durante tutta la reazione; presenta sull’asse delle x la coordinata di reazione, sull’asse delle y l’energia potenziale.

L'energia potenziale aumenta con l'avvicinamento delle molecole reagenti e, dopo aver raggiunto lo stato di transizione, diminuisce fino al raggiungimento di molecole stabili.

Condizioni operative

Rispetto ai catalizzatori inorganici (es platino, ioduro ecc), gli enzimi riescono a raggiungere la loro potenza catalitica in condizioni fisiologiche (soluzioni diluite, pH neutro, P=1atm, T=25-27°C), per di più, senza dare prodotti secondari. Gli enzimi sono in grado di fare tutto questo perché sono catalizzatori molto più complessi dei catalizzatori che si possono sintetizzare in laboratorio.

Potere catalitico

Il potere catalitico è il rapporto tra la velocità della reazione catalizzata e la velocità della reazione non catalizzata. Il potere catalitico è un fattore che indica di quante volte l’enzima è in grado di accelerare la velocità della reazione. Tale fattore varia in base all’enzima considerato e può arrivare ad un valore pari a 1710 (una reazione potrebbe durare millisecondi invece che secoli).

Specificità

Gli enzimi riconoscono in modo stereospecifico i substrati (le molecole che devono reagire).

I substrati vengono riconosciuti all'interno di una tasca, in un sito specifico di riconoscimento, chiamato sito di legame.

L’esochinasi IV, detta anche glucochinasi, è un enzima in grado di far reagire una molecola di glucosio con una molecola di ATP. L’enzima riconosce queste molecole, le lega e le posiziona nel modo corretto per poter reagire.

La glucochinasi è in grado di riconoscere solo il glucosio nella forma D, il suo enantiomero (L glucosio) e i suoi epimeri (D-galattosio e D-mannosio) non vengono riconosciuti.

Il D-glucosio differisce dall’L glucosio (non si trova in natura), dal D-galattosio e dal D-mannosio semplicemente perché ha una differente disposizione degli atomi nello spazio.

Un qualsiasi monosaccaride è di serie D se il suo ultimo C chirale (carbonio legato a 4 sostituenti diversi) presenta -OH a destra, mentre è di serie L se presenta -OH a sinistra.

• Isomeri: due molecole diverse che hanno la stessa formula bruta.
• Isomeri costituzionali o di struttura: due molecole formate dagli stessi atomi, i quali però sono collegati tra loro in modi differenti.
• Stereoisomeri: due molecole formate dagli stessi atomi, uniti tra loro nello stesso ordine, ma disposti nello spazio in maniera diversa.
• Enantiomeri: stereoisomeri che sono l’uno l’immagine speculare dell’altro.
• Epimeri: stereoisomeri che differiscono per la configurazione di un solo centro chirale.

Importanza nel metabolismo

Gli enzimi definiscono e regolano l'intricata rete di reazioni chimiche che ogni istante avvengono in un sistema vivente, facendo svolgere nel posto giusto e nel momento giusto le reazioni chimiche che servono per far funzionare al meglio le cellule e, con esse, l'intero organismo. Corredi enzimatici diversi permettono alle cellule di svolgere funzioni diverse.

Attività enzimatica

La concentrazione di enzima all’interno di una cellula non è elevata. Quindi, in genere non si misura la quantità di un enzima, ma la sua capacità di catalizzare una reazione chimica, cioè la sua attività enzimatica. L’attività enzimatica può essere misurata in catal (unità di misura dell’attività enzimatica nel SI) o con l’unità internazionale (più pratica della precedente, utilizzata nei laboratori).

• Un catal (o katal, abbreviato kat) corrisponde alla quantità di enzima che converte una mole di reagente nel prodotto in un secondo nelle condizioni ottimali di lavoro dell’enzima. Un catal è una quantità piuttosto elevata. (Nel SI l’unità di misura della quantità sostanza è la mole, mentre la quantità di misura del tempo è il secondo).
• L’unità internazionale, indicata con U o UI, corrisponde alla quantità di enzima che converte una micromole di reagente nel prodotto in un minuto nelle condizioni ottimali di lavoro dell’enzima.

Poiché 1 micromole/min = 1,67x10^-8 moli/s, 1U = 1,67x10^-8 kat -> fattore di conversione.

Proprietà strutturali degli enzimi

Ogni enzima ha una particolare struttura tridimensionale assicurata dalla particolare composizione amminoacidica di cui sono fatti. Se la struttura dell’enzima viene alterata, l'enzima non funzionerà più.

Sito attivo

La porzione dell’enzima più importante è quella che va a costituire il sito attivo. Il sito attivo di un enzima è formato dal sito di legame (porzione di molecola che riconosce e lega i substrati) e dal sito catalitico (porzione di molecola che catalizza la reazione dopo che il substrato è stato legato).

Sito di legame

Il sito di legame è una tasca in cui vengono legati i reagenti, cioè i substrati, i quali vengono riconosciuti in modo stereospecifico.

Ci sono enzimi che hanno una stereospecificità assoluta, come la glucochinasi, che è in grado di riconoscere soltanto il D-glucosio.

Ci sono enzimi invece che sono in grado di riconoscere certi tipi di legami chimici, come le proteasi a serina.

Le proteasi a serina sono:

• La chimotripsina.
• La tripsina.
• L’elastasi.

Le proteasi a serina sono delle endopeptidasi, cioè enzimi che idrolizzano i legami peptidici interni della catena polipeptidica.

Il legame peptidico è quel legame che si forma tra il gruppo carbossilico di un amminoacido il gruppo amminico dell'amminoacido successivo.

Il legame peptidico è quello segnato dalla freccetta.

Il sito di legame non serve soltanto per far accomodare il composto e prepararlo alla reazione, ma anche a riconoscere la particolare molecola che deve reagire.

In questo caso, siccome i legami peptidici sono tutti uguali, l'enzima deve essere in grado di riconoscere il tipo di amminoacido che si va ad inserire all'interno della tasca.

• La chimotripsina è specifica per gli amminoacidi aromatici (fenilalanina, tirosina e triptofano). Soltanto questi amminoacidi si possono accomodare nella tasca idrofobica presente sull’enzima. Gli altri aminoacidi, avendo un diverso tipo di struttura, non sono in grado di avvicinarsi all'enzima in modo corretto, quindi non vengono legati e il legame peptidico non viene idrolizzato.
• La tripsina nel fondo della tasca di legame presenta la catena laterale dell'aspartato, un amminoacido carico negativamente. La presenza di tale catena consente soltanto ad amminoacidi carichi positivamente (lisina e arginina -> amminoacido più basico) di potersi legare. Gli aminoacidi acidi (aspartato e glutammato) vengono respinti a causa della repulsione elettrostatica, come anche tutti gli aminoacidi che non sono in grado di formare un ponte salino. Questi amminoacidi non sono in grado di avvicinarsi in modo corretto all'enzima e quindi il legame peptidico non viene idrolizzato.

Un ponte salino è una combinazione di due interazioni non covalenti: legame idrogeno e legame ionico. Il legame a idrogeno è un particolare tipo di interazione che si viene a formare tra molecole nelle quali un atomo di idrogeno è legato covalentemente con un atomo di piccole dimensioni e fortemente elettronegativo (F, N e O). Il legame ionico è il legame che si stabilisce tra due ioni di carica opposta.

• L'elastasi presenta una tasca idrofobica piuttosto ingombrata. Essa è occupata da catene laterali che impediscono ad amminoacidi con catene laterali di grandi dimensioni di legarsi in questo sito. Gli unici aminoacidi in grado di legarsi all’elastasi sono aminoacidi che contengono una catena laterale piuttosto piccola, come la glicina (che ha la catena laterale più corta) e l'alanina. Questi sono amminoacidi mol