Microbiologia e microbiologia clinica - parte 2

Riparazione SOS e mutazioni nei microrganismi

Attraverso poi la DNA ligasi ricuce il taglio dove si ferma la polimerasi 1. •2. Il sistema “riparazione SOS” invece funziona meno bene. Si tratta di un sistema in cui si coinvolgono una serie di sistemi inducibili di riparo che si attivano se la forcella replicativa si blocca a causa di un errore (dimero di timina, base alchilata ecc.). Il sistema replica il DNA danneggiato commettendo però molti più errori della DNA polimerasi. Tutte le mutazioni indotte dai raggi UV sono il risultato di errori causati da questo sistema che non è in grado di riparare il danno.

Quando un microorganismo subisce una mutazione si verifica la modificazione dei geni legati ai flagelli prodotti. Inoltre, i geni possono essere prodotti nei flagelli che sono inadeguati poiché deputati al movimento batterico.

Il microrganismo non capsulato può perdere i geni che codificano la capsula oppure si potrà formare la capsula che è diversa da quella di partenza poiché vengono codificati i geni. Si possono verificare delle mutazioni di tipo nutrizionale nel microrganismo che può perdere gli enzimi in un ciclo biosintetico oppure può perdere la capacità di sintetizzare uno zucchero e conseguentemente perdere gli enzimi nel ciclo catabolico. Un microrganismo può subire delle mutazioni che gli permettono di diventare resistente antimicrobico, può avvenire perché l’antibiotico non è in grado di raggiungere nessuna reazione. Inoltre, si può verificare perché il microrganismo modifica il sito di azione su cui agisce l’antibiotico o può diventare capace di inattivare. Sono delle mutazioni del genotipo che si differenziano dalle variazioni del genotipo poiché un microrganismo può perdere la capsula o modificare la capsula. Non dobbiamo pensare che se un microrganismo non esprime la capsula deve aver subito una mutazione.

Possiamo inoltre individuare se l’organismo ha perso la capacità di formare flagelli o forma flagelli condizionati perché possiamo individuare delle colonie compatte. Il microrganismo a forma di flagelli forma delle colonie che diffondono nel terreno perché sulla superficie dell’Agar esso si può muovere e formerà delle colonie funzionali. Se il microrganismo perde i flagelli non porterà più a delle colonie distrutte.

Se il microrganismo perdesse la capacità di formare la capsula in un terreno solido non vedremmo più delle colonie lisce ma delle colonie rugose. Se si verificasse una mutazione nutrizionale e il microrganismo perdesse gli enzimi in un ciclo sintetico l’organismo non sarebbe più in grado di crescere in un terreno in cui il microrganismo è presente perché non è più in grado di sintetizzarsela e di crescere. Questo è il motivo per cui se individuo un organismo mutante è capace di crescere sul terreno in cui manca la sostanza che non è in grado di sintetizzare.

Se il microrganismo subisce una mutazione per cui non è più in grado di individuare uno zucchero lo potrà individuare attraverso il pH, in quanto ci permette di individuare se un organismo è in grado di fermentare, ossia di utilizzare un determinato zucchero. Per mettere in evidenza la capacità di fermentare uno zucchero il microrganismo cresce e non induce variazione di colore quando il terreno che contiene quello zucchero è un intensificatore di pH e mette in evidenza se il microrganismo utilizza quello zucchero oppure no. Se il microrganismo è diventato microbico resistente sarà in grado di crescere in un terreno dove è presente un agente antimicrobico che inibisce lo sviluppo del microrganismo sensibile. Questi sono i meccanismi che mi permettono di mettere in evidenza le mutazioni. Se consideriamo un microrganismo che inizialmente non aveva la capacità di crescere nei terreni in cui era presente la penicillina e che con il tempo iniziò a crescere in questi terreni significa che è diventato resistente alla penicillina.

Induzione delle mutazioni mediante replica plating

Possiamo indurre noi stessi delle mutazioni mediante agenti mutanti come i raggi UV che verranno isolati mediante replica plating.

Sostanzialmente cercheremmo quei microrganismi che hanno subito una mutazione in seguito all’esposizione ad un agente mutageno. Si utilizza una massa piastra che contiene un terreno completo nel quale mettiamo a disposizione tutte le sostanze di cui il microrganismo ha bisogno, e un blocco di legno nel quale viene posizionato un foglio di velluto sterilizzato. Questo viene ancorato con un anello di plastica, dopo di che come se fosse un timbro appoggiamo e pressiamo la massa piastra, così che nella superficie del velluto rimangono dei residui che vengono prelevati da ogni singola colonia.

Infine, utilizziamo il velluto per andare a seminare sia sul terreno minimo che sul terreno completo. Ovviamente sul terreno completo avremo tutte le colonie, sia quelle che hanno subito mutazione che quelle che non l’hanno subita. Mentre nel terreno minimo i mutanti non si producono e questo lo individuiamo perché vicino al terreno minimo ho utilizzato un terreno completo che protegge l’organismo e individuiamo quei microrganismi che nelle colonie non si sono sviluppati. Le isoliamo dalla piastra nel quale è presente tutto quello che il microrganismo ha bisogno e individuiamo l’agente mutante.

Nell’immagine possiamo individuare una piastra dove non si sono sviluppati e una dove si sono sviluppati.

Test di Ames

Questo test ci consente di mettere in evidenza l’attività mutagena in vitro di specifiche molecole quando si vogliono conoscere le caratteristiche tossiche di una sostanza. Non si ricorre all’impiego di animali ma si utilizzano dei batteri.

• Ames decise di indurre delle mutazioni nei ceppi di Salmonella Typhimurium His che non presentano la capacità di sintetizzarsi l’istidina poiché se non è presente l’istidina essi non sono in grado di crescere poiché hanno subito delle mutazioni e da His⁺ sono diventati His^-. Questi ceppi sono mutanti, quindi hanno subito una mutazione. Normalmente i Salmonella Typhimurium sono in grado di sintetizzarsi l’istidina mentre i ceppi utilizzati da Ames hanno subito una retromutazione per cui sono diventati His e hanno perso la capacità di sintetizzare l’istidina. Questo comporta che questi ceppi crescono soltanto su terreni nei quali sia presente l’istidina.
• Quindi mettendo a contatto His con una sostanza mutagena tale sostanza può indurre nella Salmonella Typhimurium delle mutazioni che in questo caso sono delle retromutazioni per cui si può far riacquisire al microrganismo la capacità di crescere anche in un terreno nel quale non è presente l’istidina. Quindi su un microrganismo mutato, una mutazione può indurre retromutazione per cui il microrganismo riacquisisce la capacità di crescere anche in terreni in cui è assente l’istidina o è presente in poca percentuale.

Retrotitolare significa andare ad individuare delle mutazioni che gli consentano di diventare His⁺, ossia di riacquisire nuovamente l’istidina così che il microrganismo ha la capacità di sintetizzare nuovamente l’istidina. Se il microrganismo sintetizza l’istidina è in grado di crescere in terreni nel quale essa è presente.

Se utilizzassi 10 milioni di cellule crescerebbero 10 mutanti spontanei che riacquisterebbero la capacità di crescere anche in condizioni di assenza di istidina. Se invece nella mia provetta contenente il microrganismo aggiungo una sostanza che induce una mutazione e la vado a piantare sullo stesso terreno con concentrazione minime di istidina, quello che succede è che si sviluppano tantissimi organismi mutanti, che da His^- diventano His⁺, ovvero riacquisiscono la capacità di sintetizzare l’istidina e consentono lo sviluppo elevato di colonie. Il numero di colonie che si formano è elevato perché il mutageno ha la capacità di crescere anche in assenza di istidina.

Trasferimento genico nelle cellule batteriche

Le variazioni nel genotipo (genotipo significa inserimento alla progenie) delle cellule batteriche non si verificano solamente tramite delle mutazioni ma si possono verificare anche tramite i meccanismi che comportano un trasferimento genico. Le cellule batteriche permettono il passaggio dei geni da una cellula donatrice ad una cellula ricevente.

Questo si può verificare attraverso trasformazione, ovvero tramite DNA extracellulare, cioè il DNA deve essere libero; coniugazione, in cui si deve verificare un contatto fisico tra la cellula donatrice e quella ricevente; e trasduzione, che è il trasferimento mediante virus batterici definiti batteriofagi o fagi.

Esperimento di Griffith e trasformazione

Per spiegare il meccanismo della trasformazione parliamo dell’esperimento di Griffith (1929). Griffith non era un microbiologo ma era un immunologo; infatti, cercava di immunizzare dei topini nei confronti dello Streptococcus pneumonie (microrganismo che può determinare la polmonite), osservando quello che succedeva utilizzando diversi ceppi. I microrganismi possono essere dotati di capsula, per questo possiamo trovarli in due differenti fasi: una fase S in cui il microrganismo è capsulato e una fase R in cui invece il microrganismo non è capsulato. La capsula protegge il microrganismo ed è anche un fattore importante di virulenza, per questo quando il microrganismo è capsulato è virulento; quindi, è in grado di determinare malattie. Mentre quando il microrganismo non è capsulato non è virulento.

Griffith eseguì un esperimento in cui utilizzò sia microrganismi in fase S (virulenti e vivi) che microrganismi in fase R. Quando utilizzava delle cellule vive virulente e le somministrava al topo, questo moriva. Quando invece somministrava cellule vive non virulente questo non moriva. Quando però utilizzava delle cellule virulente morte (uccise dal calore), queste in teoria dovrebbero essere in grado di uccidere il topo, ma essendo morte il topo continuava a vivere. Infine, per l’ultimo esperimento utilizzò un miscuglio di cellule virulente morte e cellule non virulente vive, il topo moriva nuovamente. Da questo topo vennero poi trovate delle cellule vive dotate di capsula. Quindi quelle che lui utilizzava morte, le trovava vive e ovviamente lui non essendo un microbiologo non capì bene cosa succedeva realmente.

(Se lo raccontiamo così non capisce nulla)

Quello importante da capire è che la capsula di Streptococcus pneumonie è dotata di polisaccaridi che sono molto diversi tra loro; infatti, nella specie ne sono stati isolati oltre 90 tipi differenti poiché differiscono per il tipo di polisaccaride che interviene nella formazione della capsula.

Griffith utilizzò microrganismi che differivano tra loro per il tipo di capsula, per cui aveva utilizzato dei microrganismi di tipo 2 e tipo 3 (sono entrambi degli Streptococcus pneumonie ma differiscono per il tipo di saccaride). Quando utilizzava microrganismi di tipo 3 vivi virulenti (S) il topo moriva, quando utilizzava il tipo 2 vivo non capsulato (R) il topo non moriva. Se invece utilizzava i microrganismi di tipo 3 in fase S (virulenti) ma morti (perché venivano uccisi con il calore) il topo continuava a vivere.

Infine nel suo quarto esperimento fa un miscuglio tra cellule vive di tipo 2 non virulente (privi di capsula) e cellule di tipo 3 virulenti (capsulati) morti e il topo muore. Quindi quei microrganismi che da soli non sono in grado di determinare la morte del topo quando li inietta insieme nei tessuti si evidenziarono dei microrganismi vivi di tipo 3 in fase S, ovvero isola vivi quei microrganismi che lui aveva utilizzati morti. Questo non è assolutamente possibile perché i microrganismi che avevamo utilizzato morti sono andati incontro a lisi e hanno così riversato all’esterno il loro contenuto citoplasmatico, tra cui il DNA. Il DNA è stato acquisito in parte da quei microrganismi che lui aveva utilizzato in fase R, quindi quei microrganismi vivi non capsulati. Per cui i microrganismi che ritroviamo nelle ultime fasi non sono i microrganismi che sono stati utilizzati morti ma sono i microrganismi che lui aveva utilizzato vivi che hanno acquistato i geni che codificano per la capsula.

Meccanismo della trasformazione

Il meccanismo della trasformazione batterica si verifica, dunque, quando frammenti di DNA extracellulare (circa 20 geni) possono essere donati da un batterio che va incontro a lisi ed integrati nel cromosoma, ovviamente se presente omologia, della cellula ricevente mediante un meccanismo di rottura-riunione. La cellula ricevente presenta sulla superficie una proteina che si chiama DNA plating, molecola che può legarsi con il DNA extracellulare. Legandosi al DNA che trova nell’ambiente lo porta all’interno e se il filamento del DNA delle cellule riceventi trova un’omologia si può integrare nel cromosoma.

Il DNA trasformante nella trasformazione deve avere determinate caratteristiche:

• Deve essere extracellulare, ossia libero nell’ambiente;
• Deve avere un PM >10⁶ Da;
• Deve essere a doppia elica;
• Deve avere un elevato grado di omologia con il DNA della cellula ricevente, stipiti della stessa specie o specie tassonomicamente vicine, come Bacillus licheniformis e Bacillus subtilis che sono due cellule diverse ma entrambi appartengono allo stesso genere.

Poiché una cellula possa essere trasformata dovrà essere una cellula competente, ovvero che si deve trovare in una condizione di competenza. Una cellula si trova in fase di competenza quando produce un fattore di competenza, ma in realtà non è uno solo, ma sono tanti. Questi fattori di competenza sono la sintesi del DNA della cellula che viene in qualche modo bloccata. Inoltre, si verifica un rallentamento della sintesi della parete cellulare, mentre ovviamente la sintesi proteica si deve mantenere attiva. Abbiamo un aumento dell’elettronegatività superficiale e questo è indispensabile perché si possa avere un avvicinamento del DNA esogeno della cellula donatrice alla cellula ricevente.

Inoltre, si verificherà una degradazione parziale della parete cellulare attraverso degli enzimi specifici così che il DNA possa attraversare la parete. Sulla superficie saranno presenti dei recettori che le consentono di legare il DNA extracellulare. Inoltre, sulla superficie la cellula dovrà esprimere una proteina che si chiama DNA binding, ossia una proteina capace di legare il DNA che gli consenta di legare il DNA all’esterno della cellula, degradare la parete cellulare e entrare all’interno come se assumesse delle sostanze dall’esterno.

Questi recettori riconoscono e legano il DNA trasformante (DNA binding) e sono saturabili, ovvero una cellula che si trova in condizioni di competenza ha un numero limitato di DNA binding. Il periodo di competenza dipende dalla specie batterica, per esempio nello S. pneumoniae, B. subtilis e H. influentiae lo ritroviamo nell’ultimo periodo della fase esponenziale, mentre nel N. meningitidis all’inizio della fase logaritmica. Poiché una cellula venga trasformata deve soddisfare queste competenze contemporaneamente.

Una volta che la cellula si trova in competenza può ricevere il DNA esogeno, ma come avviene che il DNA che proviene dalla cellula donatrice si vada poi a trasferire nella cellula ricevente?

Abbiamo un primo step in cui si ha un legame del DNA con i siti recettoriali disposti sulla cellula ricevente, successivamente, se parliamo di microrganismi Gram positivi, si verificherà l’azione di una endonucleasi che agisce all’esterno della cellula, ovvero l’azione di un enzima che scinde i due filamenti in modo tale che ne rimanga solo uno. Mentre nei Gram negativi saranno presenti due filamenti. Successivamente si verifica la fase di penetrazione, una fase di eclisse che nei Gram negativi porterà la scissione dei due filamenti. Infine, il DNA monoelica si appaia e si integra per rottura e riunione. Il DNA che si forma è molto piccolo, a singola elica e sempre se sono presenti delle condizioni di omologia, si integra. Avviene solo se c’è omologia.

Meccanismo di trasferimento di DNA mediante trasformazione in un batterio positivo

• Legame del DNA libero ad una proteina di membrana (DNA binding).
• Passaggio di uno dei due filamenti all’interno della cellula. L’altro filamento è degradato dalla nucleasi.
• La proteina RecA determina la ricombinazione con regioni omologhe del DNA.

12/04: Punti salienti della lezione precedente

Per quanto riguarda la trasformazione non bisogna far riferimento solo all’iniziale assenza e poi comparsa della capsula, ma si deve sottolineare l’acquisizione dei geni che codificano per una capsula differente da quella che il microrganismo normalmente presenta.

Affinché ciò avvenga, il DNA trasformante deve avere determinate caratteristiche, es. peso molecolare adeguato, e la cellula che riceve il DNA extracellulare deve ritrovarsi in una condizione di competenza. Inoltre, i microrganismi devono essere tassonomicamente vicini, microrganismi della stessa specie o dello stesso genere, perché altrimenti non si troverebbero le zone di omologia che consentono la migrazione del DNA trasformante sul DNA della cellula ricevente.

Ci sono delle differenze tra la trasformazione che si verifica nei microrganismi Gram+ e quella che si verifica nei Gram-: nel primo caso, l’endonucleasi, enzima che converte il DNA bicatenario in DNA a singolo filamento, agisce quando il DNA si trova sulla superficie della cellula, all’esterno; nel secondo caso, agisce quando il DNA si trova all’interno della cellula.

Non detto a lezione

Un altro sistema che possiamo utilizzare in laboratorio per trasformare le cellule è il trasferimento di DNA mediante elettroporazione che consiste nell’esposizione delle cellule a campi elettrici pulsanti (per pochi millisecondi): si formano così pori nella membrana attraverso i quali possono poi passare