Microbiologia completo

Batteriologia

Introduzione alla batteriologia

Dal punto di vista ecologico, i batteri possono essere:

• Saprofiti → conducono vita nell’ambiente
• Parassiti → conducono vita a spese di altri organismi

Il rapporto fra batteri e organismi parassitati può essere di:

• Commensalismo se reciprocamente indifferente
• Simbiosi se reciprocamente vantaggioso
• Patogenicità se la presenza del batterio porta a un danno tissutale oppure funzionale per l’organismo.

Sulla base delle caratteristiche del processo infettivo, i batteri patogeni possono essere distinti in patogeni occasionali, obbligati, opportunisti.

Infezione

Per infezione si intende la colonizzazione di tessuti dell’organismo ospite da parte di batteri e lo sviluppo di una popolazione batterica. Le infezioni possono essere distinte in:

• Endogene, causate da batteri già presenti nell’organismo come commensali (sorgente interna)
• Esogene, causate da batteri provenienti dall’ambiente (sorgente esterna)

Le caratteristiche dinamiche dell’evoluzione del processo infettivo dipendono dall’interazione tra batterio e organismo:

• Caratteristiche del batterio
• Condizioni fisiologiche dell’ospite
• Capacità di sviluppare una risposta antibatterica, costitutiva oppure immunitaria specifica

Flora microbica normale

Numerosi microrganismi colonizzano l’uomo, dopo la nascita, formando ecosistemi complessi (microbioti) che svolgono diverse funzioni utili:

• Secrezione di vitamine (K e B12) che vengono assorbite dall’ospite.
• Effetto barriera nei confronti di patogeni esogeni.
• Produzione di sostanze (acidi grassi, perossidi, acidi) che inibiscono o uccidono i patogeni esogeni.
• Stimolazione dello sviluppo del tessuto linfatico associato alle mucose (MALT).
• Induzione della produzione di anticorpi naturali, che possono prevenire infezioni da patogeni esogeni.

I principali microrganismi sono situati: nell’area nasale, nell’area faringea, nella bocca, nella cute, nello stomaco, nell’intestino, nell’intestino tenue, nell’area vaginale e nell’uretra. La maturazione del microbiota umano si determina al raggiungimento di un equilibrio qualitativo e quantitativo estremamente delicato e precario, in circa due anni dalla nascita. Nei limiti delle possibili fluttuazioni, la flora normale dell’uomo (costituita per il 99% da centinaia di specie batteriche) rimane sufficientemente costante:

• 10¹² batteri sulla cute
• 10¹⁰ nella bocca
• 10¹⁴ nella mucosa gastrointestinale

Infezioni endogene

• Espansione numerica abnorme di una o più specie microbiche commensali per squilibrio dell’ecosistema microbico (es. vaginiti da Candida albicans, in seguito a terapie antibatteriche che riducono le specie batteriche commensali concorrenti)
• Trasferimento di microrganismi commensali da un distretto a un altro dell’organismo (es. cistiti da E. coli)
• Decadimento dello stato fisiologico dell’organismo
• Depressione delle risposte antibatteriche costitutive oppure immunitarie specifiche

Infezioni esogene

Sono caratterizzate dall’arrivo, nell’organismo, di un microrganismo o di un virus patogeno proveniente da una sorgente esterna:

• Materiali inanimati
• Animali infetti (zoonosi)
• Uomo infetto (malattie infettive o contagiose)

Vie di trasmissione

Un microrganismo (o un virus) patogeno, agente di un’infezione esogena, può raggiungere un organismo umano attraverso diverse vie di trasmissione:

• Alimentare (circuito oro-fecale)
• Aerea, respiratoria o inalatoria
• Sessuale
• Parenterale (inoculazione nei tessuti profondi o nel sangue) mediante veicoli inanimati (stoviglie, indumenti, strumenti chirurgici, alimenti, acqua, aria, ecc), oppure mediante vettori animati (artropodi quali zanzare, pulci, zecche, ecc)

La trasmissione interumana delle malattie infettive può avvenire per via orizzontale → da un individuo malato (o da un individuo portatore sano) a uno sano (per via aerea, alimentare, sessuale, per puntura di insetti ematofagi, per inoculazione di sangue infetto).

La trasmissione interumana delle malattie infettive può avvenire per via verticale:

• Dalla madre al feto per via transplacentare (infezione congenita)
• Dalla madre al neonato, attraverso il canale del parto (infezione perinatale)
• Dalla madre al neonato tramite l’allattamento (infezione postnatale)

Infezioni esogene e malattia

• L’infezione esogena, che presuppone l’arrivo di microrganismi o virus dall’esterno dell’organismo al suo interno, si trasforma in malattia da infezione quando, dopo un periodo di incubazione, si ha la comparsa di sintomi di sofferenza.
• L’infezione si traduce in malattia se e quando il potere patogeno del microrganismo (o virus) è in grado di sopraffare le difese dell’organismo, o quando le difese dell’organismo sono compromesse (infezioni opportunistiche)

Organizzazione cellulare

Due tipi fondamentali di organizzazione cellulare:

• Procariotica: assenza di compartimentazioni intracellulari
• Eucariotica: presenza di compartimentazioni intracellulari

La cellula batterica è più piccola rispetto a una cellula animale (intorno ai 10 micrometri) e anche di una cellula vegetale (fino a 100 micrometri). Il batterio è intorno al micrometro. Al di sotto dei batteri ci sono i virus che vanno dai 10 fino ai 450 nanometri e poi al di sotto delle dimensioni dei virus ci sono le piccole macromolecole che vanno dall’Armstrong al nanometro. I batteri sono sulla soglia del potere risolutivo del microscopio. Il microscopio ottico non vede sotto il micron. Per osservare i batteri guardiamo le colorazioni.

Cellula procariotica: tecniche di studio

Microscopia ottica

Il microscopio ottico è costituito da un sistema di lenti con distanza focale molto piccola; il campione da osservare è illuminato con luce visibile o ultravioletta, ed è possibile risolvere con dimensioni dell’ordine di 0.2 micrometri (µm). In microbiologia si utilizzano diversi tipi di microscopio ottico: microscopio in campo chiaro (luce visibile normale), in campo oscuro, a contrasto di fase, a fluorescenza. Potere di risoluzione: la capacità di una lente di distinguere due oggetti piccoli molto vicini tra loro.

Colorazione semplice

Le cellule batteriche così come sono visibili sia al microscopio ottico ma non riusciamo a definirne la forma e il tipo di aggregazione; quindi, abbiamo bisogno dell’aiuto di coloranti (colorazioni semplici e differenziali). Semplici utilizzano un solo colorante, mentre le differenziali due in sequenza.

Per le colorazioni semplici possiamo usare coloranti basici o acidi, posto che la carica della cellula batterica è negativa. Se usiamo colorante basico (carica positiva) questo penetrerà nella cellula batterica e la colorerà completamente (cellula colorata in campo incolore). Viceversa, se utilizziamo colorante acido (carica negativa) per repulsione il colorante si depositerà all’esterno della cellula batterica, colorerà il fondo del nostro preparato e per contrasto vedremo la cellula incolore sul fondo colorato.

Tutti i vetrini per colorazione si preparano a partire da un vetrino portaoggetto, un vetrino sulla cui superficie depositiamo una sospensione batterica. Dopo lasciamo asciugare il vetrino all’aria in modo tale che l’acqua evapori e poi passiamo alla fissazione del vetrino (fissazione al calore), ovvero passiamo sulla fiamma di un Bunsen per tre volte il vetrino e questo consente di uccidere i batteri nel nostro preparato (più maneggevole e senza rischi dal punto di vista biologico) e rende più permeabili le cellule batteriche ai coloranti. Altrimenti per la fissazione possiamo usare dei trattamenti chimici: miscele di alcol e acidi (metanolo e acetone al 50% ha lo stesso effetto di una fissazione a calore).

Una volta che abbiamo deposto i batteri, fatto evaporare l’acqua, fissato a calore o con agenti chimici il nostro preparato, possiamo colorarlo. Mettiamo una quantità di colorante necessaria per coprire i batteri, lasciamo agire qualche minuto poi risciacquiamo con acqua corrente. Poi andiamo ad osservare al microscopio ottico la nostra preparazione.

Colorazione differenziale

La colorazione più nota è quella di Gram (1800). I batteri gram positivi e gram negativi, per il tipo di colorazione che assumevano i batteri inserendo a sequenza i due coloranti. La parte iniziale della colorazione di Gram è identica alla colorazione semplice (preparazione del vetrino fino alla fissazione). Ricopriamo il nostro vetrino con un primo colorante (cristalvioletto → colore blu/viola) lasciamo agire per un minuto e aggiungiamo una soluzione che si chiama liquido di Lugol (soluzione mordenzante) che è una soluzione di iodio e ioduro di potassio. Lasciamo agire un minuto e laviamo con acqua corrente. Lo scopo del mordenzante è quello di favorire il mantenimento della colorazione della cellula batterica (blu). Le cellule che verranno definite gram positive (mantengono colorazione blu violetta) mentre le cellule che verranno decolorate (incolore) potranno assumere un secondo colorante (rosso) e queste cellule assumeranno questa seconda colorazione e sono dette gram negative.

Colorazione di Ziehl-Neelsen

Ci sono alcune cellule che necessitano di una particolare procedura di colorazione.

• L’alcool-acido resistenza costituisce la base per il riconoscimento dei Micobatteri, secondo il metodo di Ziehl-Neelsen.
• Questi batteri, per la presenza di particolari sostanze che ne rivestono la cellula, hanno la capacità di trattenere la colorazione con fucsina di Ziehl, anche se trattati con energici decoloranti come l'alcool e gli acidi minerali (H₂SO₄ al 20%) [Fucsina di Ziehl (o fenicata): soluzione di fucsina basica all’1% circa in etanolo al 10% e fenolo al 5%.]

Il fenolo è altamente denaturante, consente di far penetrare il colorante all’interno di queste cellule batteriche e una volta che questo colorante è penetrato non viene decolorato neanche se uso un decolorante molto potente. La preparazione del vetrino è sempre la stessa, poi utilizziamo la fucsina fenicata, lasciamo agire qualche minuto (tecnica a caldo) e scaldando su una fonte di calore il vetrino finché non inizia a comparire il vapore (non facciamo bollire). Questo facilita l’ingresso del colorante, dopo laviamo in acqua corrente e a questo punto proviamo a decolorare con acido solforico al 20%, laviamo ancora e aggiungiamo un secondo colorante, il blu di metilene, che colorerà soltanto il fondo del vetrino. Ci saranno ammassi di colore rosso in campo blu. Questi batteri sono gli unici che non possiamo far rientrare nella colorazione di gram.

Microscopia elettronica

Nel microscopio elettronico la radiazione utilizzata per "illuminare" il campione da osservare è costituita da un fascio di elettroni, fatto convergere per mezzo di lenti elettromagnetiche. L'immagine ottenuta può essere visualizzata direttamente su un monitor o essere fissata fotograficamente. Il potere risolutivo (0.5 nm = 5x10^-7 mm) è più di mille volte superiore a quello dei microscopi ottici. A seconda che l'immagine sia prodotta dagli elettroni trasmessi da un preparato ultrasottile, oppure da quelli riflessi punto a punto dalla superficie di un campione, si distinguono il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) e quello a scansione (SEM).

• Trasmissione → immagine bidimensionale
• Scansione → immagine tridimensionale (aggregazione delle cellule batteriche e le interazioni e caratteristiche delle cellule batteriche)

Grazie a queste informazioni abbiamo potuto comprendere più chiaramente perché le cellule batteriche si comportino in maniera diversa nella colorazione di gram.

Cellula procariotica: forma, disposizione

I cocchi sono cellule sferiche, disposti in diversi arrangiamenti in base alla diversa successione dei piani di divisione cellulare. Questi batteri possono essere singoli o uniti a due a due (diplococchi), possono essere uniti a gruppi di quattro (tetradi) o a 8 (sarcina). Possono formare delle catenelle (streptococchi) o essere distribuiti a grappolo o raggruppamenti irregolari (stafilococchi). Tutti i cocchi con un’unica eccezione (diplococchi che sono gram negativi che sono le neisserie, responsabili della meningite o della gonorrea nell’uomo) sono gram positivi.

I bacilli sono cellule cilindriche, disposti in base alla successione dei piani di divisione cellulare. Possono essere singoli o a coppie (micro-bacilli), a catenelle (streptobacilli) o coccobacilli. La maggior parte sono gram negativi.

Le cellule spirali possono presentarsi in tre diverse forme: vibrione, spirillo, spirocheta. Non tutti i bacilli sono semplicemente dei cilindretti più o meno lunghi, possiamo avere delle variazioni rappresentate dal vibrione (bacillo incurvato lungo il suo asse inferiore). I vibrioni più famosi sono quelli del colera. Gli spirilli hanno più curvature sull’asse maggiore, se le curvature sono più di una e il batterio è molto più lungo parliamo di spirilli (lectospira), batterio che si trova nelle acque superficiali come contaminante. Spirilli più sottili e avvolti a spirale sono le spirochete (microscopia in campo scuro, difficili da colorare).

Cellula procariotica: struttura

DNA libero nel citoplasma. Citoplasma gel acquoso molto simile a quello di ogni altra cellula e all’interno sono presenti solo i ribosomi, che possono essere liberi nel citoplasma o associati alla membrana citoplasmatica. Possiamo avere delle strutture che sono granuli di accumulo o corpi di intrusione che sono riserve di materiali. La membrana plasmatica delimita il citoplasma, la parete batterica (struttura diversa tra gram positivi e negativi) costituita da un polimero (peptidoglicano) ed esternamente, nei gram negativi, un’ulteriore membrana (la membrana esterna). Struttura accessoria come la capsula, i pili o fimbrie che sono meccanismi di adesione alle cellule del nostro organismo e i flagelli nei batteri mobili.

Cellula procariotica: materiale genetico

DNA circolare e spiralizzato. Corredo genetico aploide, non ci sono proteine basiche associate a questo DNA e questo DNA è libero nel citoplasma, non delimitato da membrana nucleare. In alcune fasi della replicazione della cellula batterica questo DNA può ancorarsi alla membrana citoplasmatica. DNA >10 coppie di basi circolare, superavvolto, corredo genetico aploide non complessato a proteine basiche, ancorato alla membrana cellulare. DNA, 10³ - 10⁵ coppie di basi circolare, superavvolto presenti in numero variabile di unità replicative autonome. (In alcune specie batteriche c’è la particolare presenza di ulteriore DNA di dimensioni più piccole 10³, 10⁵ coppie di basi, circolare e presente in una singola copia o un numero variabile di coppie, a copia singola o multicopia). Questi plasmidi hanno in sé tutti i geni che servono a resistere a diversi farmaci antibatterici, questi plasmidi possono essere scambiati tra le cellule batteriche, quando anche in una popolazione batterica sensibile a un antibiotico si seleziona una singola cellula con questo plasmide resistente, questa cellula può trasmettere questo plasmide alle altre in tempi brevissimi e rendere la popolazione resistente al farmaco.

Cellula procariotica: citoplasma

Non c’è un nucleo. Non c’è la membrana nucleare. Ci sono granuli di accumulo. È la sede della replicazione e trascrizione del materiale genetico. È la sede di attività metabolica con possibile formazione di granuli di accumulo:

• Granuli di lipidi (polimeri dell’acido beta-idrossibutirrico)
• Granuli di polisaccaridi (glicogeno e amido)
• Granuli di zolfo (solfobatteri)
• Granuli di ferro (ferrobatteri)
• Granuli di polifosfati

[S: indice di sedimentazione] Sede della sintesi proteica sono i ribosomi 70S (unici organuli nel citoplasma), costituiti da due subunità:

• 30S (RNA 16S, 21 proteine)
• 50S (RNA 5S, RNA 23S, 34 proteine)

I ribosomi formano unità funzionali dette polisomi, e sono liberi nel citoplasma, oppure in contatto con la membrana plasmatica. Non c’è il reticolo endoplasmatico a cui possono attaccarsi, ma la funzione non cambia. Sono più piccoli rispetto alla cellula eucariotica.

Cellula procariotica: membrana citoplasmatica

Funzioni:

• Permeabilità selettiva e trasporto di metaboliti
• Trasporto di elettroni e fosforilazione ossidativa
• Funzioni biosintetiche
• Secrezione di enzimi
• Ruolo nella divisione cellulare
• Ruolo nella formazione di spore (forme di resistenza batterica prodotte soltanto dal genere Bacillus e Clostridium)

Tutti i processi metabolici avvengono a livello della membrana plasmatica (perché c’è assenza di mitocondri).

Cellula procariotica: parete cellulare

La parete cellulare è costituita da una serie di involucri organizzati diversamente per le diverse classi di batteri. Sia graficamente che morfologicamente ci sono profonde differenze. Le organizzazioni maggiormente rappresentative sono relative ai batteri Gram+, Gram- e acido-resistenti. La funzione principale degli involucri è di dare forma, resistenza meccanica e protezione alla cellula batterica. La parete cellulare è principalmente composta da un complesso molecolare denominato peptidoglicano. Organizzazione della parete cellulare di batteri acido-resistenti. La parete cellulare è composta da uno strato di peptidoglicano complessato a polisaccaridi, acidi grassi (acidi micolici) e cere. Organizzazione della parete cellulare di batteri Gram positivi La parete cellulare è composta da uno spesso strato di peptidoglicano complessato.