Microbiologia

Microbiologia

Classificazione in regni degli organismi viventi

1. Monera (unicellulari procarioti a riproduzione asessuata, autotrofi o eterotrofi)

2. Funghi (eucarioti unicellulari o pluricellulari a riproduzione asessuata e/o sessuata, eterotrofi o autotrofi)

3. Protisti (unicellulari eucarioti a riproduzione sessuata e/o asessuata, eterotrofi o autotrofi)

4. Piante

5. Animali.

Principali differenze tra cellula eucariotica e procariotica

Cellula eucariotica: ha un nucleo e un nucleolo, contiene diversi cromosomi (ognuno formato da diverse molecole di DNA), la parete si trova in alghe e funghi, la membrana citoplasmatica contiene steroli; vi sono mitosi e meiosi, ribosomi maggiori di dimensioni, la respirazione è associata ai mitocondri mentre la fotosintesi ai tilacoidi (inclusi in un cloroplasto); la motilità è legata a flagelli. Si riproducono per via sessuata e asessuata e sono più grandi dei procarioti. Sono aerobi.

Cellula procariotica: non hanno nucleo e nucleolo, vi sono cromosomi singoli costituiti da DNA, la parete si trova in tutti eccetto i micoplasmi e sono assenti gli steroli; non hanno mitosi e meiosi, contengono ribosomi, la respirazione è associata alla membrana citoplasmatica mentre la fotosintesi è associata in alcuni a tilacoidi in altri no; la motilità è legata a flagelli. Si riproducono per via asessuata (fissione binaria) e sono di dimensioni minori degli eucarioti. Sono aerobi e anaerobi.

Virus

Entità biologiche subcellulari:

• Parassiti endocellulari obbligati
• Hanno un solo tipo di acido nucleico (DNA o RNA)
• Sono piccolissimi
• Hanno un capside e spesso un pericapside
• Hanno in superficie anti recettori che si legano con i recettori nella cellula bersaglio
• Sfruttati per entrare nelle cellule

Evoluzione microbiologica

• Petri: con terreni solidi mettendoli in contenitori di vetro
• Colorazione di Gram: consente di distinguerli in positivi e negativi in base alla conformazione della parete
• Pasteur: fece per primo le vaccinazioni contro il carbonchio e antirabica. Il primo fu contro il vaiolo (Edward Jenner)
• Koch: ha isolato in coltura i batteri patogeni dimostrando che erano gli agenti eziologici
• Fleming: scopre la penicillina
• Watson e Crick: scoprono la doppia elica del DNA

Questo fino ad arrivare alla microbiologia medica odierna che tratta la micologia, batteriologia, virologia e parassitologia. I virus possono essere virus a DNA o virus a RNA. Sono microscopici e possono essere visti solo al microscopio. Ne abbiamo diversi tipi: microscopio ottico (tramite sorgente luminosa), elettronico (tramite un fascio di elettroni), in campo oscuro (con fondo scuro per mettere in evidenza composti non colorati e sottili), a contrasto di fase e a fluorescenza (tramite una lampada a vapore di mercurio o altro); possono inoltre essere microscopi a scansione o a trasmissione. Ci consentono di localizzare i batteri e di definirne la forma. Al microscopio posso fare visualizzazioni a fresco o con preparati fissati e colorati tramite coloranti vitali (mantengono vivo il batterio) o quelli usati dopo la fissazione (coloranti anionici, cationici e fluorescenti). Per fissare un virus si usano i mordenzanti.

Tipologie di colorazioni

• Semplici: un solo colorante per preparazioni mono microbiche. Es. blu di metilene
• Complesse differenziali: 1° colorante, decolorante poi 2° colorante. Questo si fissa solo a quelle decolorate, le altre mantengono la prima colorazione. Es. Gram, Ziehl-Neelsen
• Negative: si colora il sottofondo di cellule vive e non fissate
• Con metalli pesanti: si depositano e accentuano quello elettron denso ed elettron trasparente

Di Gram: mi suddivide i batteri in gram positivi (blu) e gram negativi (rosa). 1° colorante Cristal-violetto colora entrambi, mordenzante, decolorante (alcol o acetone): nei gram positivi rimane il primo colorante, nei gram negativi viene via il colore. Poi 2° colorante rosso-safranina: i gram positivi rimangono blu, quelli negativi diventano rosa e la colorazione dura 2-3 minuti.

Di Zehl-Neelsen: per i micobatteri: 1° colorante fucsina scaldando per far colorare tutto il vetrino di rosa, decolorazione con una miscela di acido forte-alcol ed entrambi i gram si decolorano, 2° colorante blu di metilene: si colorano tutti tranne i bacilli acido-alcol resistenti.

Metacromatica: colorante rosa: darà una colorazione di blu

Impregnazione argentica: sali di argento che, depositandosi sul corpo batterico, lo risaltano

Cellula batterica

Acido nucleico: unica molecola di DNA circolare spiralizzato nel citoplasma. Contiene rRNA (diverso per ogni specie; i ribosomi hanno due subunità una più grande dell’altra e si uniscono durante la sintesi proteica), mRNA e tRNA.

Membrana citoplasmatica: è trilaminare fosfolipidica poiché i due strati sono elettron densi mentre quello interno fra i due è elettron trasparente. All’interno troviamo proteine di membrana, glicolipidi e oligosaccaridi. I micoplasmi (batteri) non contengono la parete e quindi la membrana è l’unico confine. La parete è uno dei principali bersagli farmacologici quindi sono poco attaccabili. Le forme L invece hanno la parete ma possono perderla.

Funzioni della membrana

1. Produzione dell’energia ATP con citocromi e ATPasi poiché non ha organelli
2. Enzimi per la formazione della parete
3. Sede dei meccanismi di trasporto: è attraversata solo da molecole liposolubili e piccole secondo gradiente di concentrazione; per gli altri servono trasportatori: diffusione facilitata (proteine transmembrana), trasporto attivo (tramite trasportatori ABC con un complesso di una proteina che lega il substrato e il complesso trasportatore oppure tramite il sistema della fosfodiesterasi dove il fosfato del PEP va al substrato successivamente alla fosforilazione.

Parete cellulare: ce l’hanno tutti i batteri tranne i micoplasmi. Solo i procarioti hanno la parete fatta di peptidoglicano. Ha la funzione di conferire forma e rigidità, resiste alla pressione osmotica. Differenze di parete tra:

1. Gram positivi: parete più semplice tutto ciò che è al di là della membrana con sottile strato di peptidoglicano, piccolo spazio periplasmico e fuori la membrana citoplasmatica. Oltre al peptidoglicano ci sono anche acidi teicoici e lipoteicoici legati ai fosfati a cui possono essere legate catene laterali di alanina, glucosio o altro e possono essere i determinanti antigenici che vengono riconosciuti dal sistema immunitario come non-self.
2. Gram negativi: la parete è più complessa: peptidoglicano più sottile, spazio periplasmico con dentro enzimi e proteine di Braun. La parte più esterna della membrana ha un lipopolisaccaride (struttura fibrillare con porzione lipidica e saccaridica ed ha funzione patogenetica), formato da:
   • Lipide A (parte più interna) formata da due zuccheri + 4 acidi grassi + fosfato: porzione tossica del lipide
   • Core saccaridico intermedio formato da zuccheri
   • Catene flessibili verso l’esterno formate da polisaccaridi e sono anche antigeni quindi vengono riconosciuti dal SI.

Il peptidoglicano è un ottimo bersaglio dei farmaci; è formato da aminoacidi + zucchero. Polimero di molti monomeri: ogni monomero è formato da due aminozuccheri: acido N-acetilmuramico (a cui è legata la parte peptidica di 5 aminoacidi e poi il 5° si perde: L-alanina, acido D-glutammico, acido mesodiaminopimelico nei positivi e L-lisina nei negativi e D-alanina) e N-acetilglucosamina con legame beta 1-4. Il legame nei positivi è diretto, nei negativi è mediato da un ponte pentaglicinico.

Sintesi del peptidoglicano

• Inizia nel citoplasma sintetizzando monomeri trasferiti poi all’esterno della membrana tramite un trasportatore.
• Sintesi N-acetilglucosamina NAG-P + UTP → UDP-NAG + PEP → N-acetilmuramico UDP-NAM. Passaggio bloccato da fosfomicina.
• UDP-NAM + 5 Aminoacidi (L-alanina, acido D-glutammico, L-lisina/acido mesodiaminopimelico, D-alanina dove inizialmente era L-alanina e formazione dimero D-alanina-D-alanina). La formazione del dimero è inibita dalla cicloserina.
• NAM-pentapeptide va alla membrana tramite bactoprenolo (trasportatore), il monomero va sulla faccia interna della membrana e i polimeri vengono stabilizzati da ponti pentaglicinici.
• Il bactoprenolo viene defosforilato e slega il NAM che si lega alla catena di peptidoglicano esistente. Questo passaggio è inibito da bacitracina.
• Le transpeptidasi stabilizzano la catena di peptidoglicano con ponti trasversali.
• Rottura legame D-alanina-D-alanina per produrre energia e formare legame trasversale ed è il sito di attacco dei beta-lattamici che bloccano le trans peptidasi. I glicopeptidi invece fanno la stessa cosa dei beta-lattamici ma legandosi al dimero che non si romperà e non avremo formazione di energia. La vancomicina blocca l’aggiunta di unità al peptidoglicano.

Parete dei micobatteri

La parete dei micobatteri è spessa e ricca di lipidi e per colorarla si usa la colorazione di Ziehl-Neelsen. È formata da peptidoglicano + arabinogalattani + acidi micolici (esterno) a cui si legano anche fosfoglicolipidi e micosidi. I lipidi in superficie possono avere il fattore cordale (di virulenza) che determina una grave malattia per quei ceppi che lo contengono poiché i bacilli si aggregano tra di loro e lo rendono più virulento.

Strutture esterne facoltative dei batteri

• Capsula, strato mucoso, glicocalice e strato S: favoriscono adesione, resistenza ad essiccamento e verso sostanze tossiche, virulenza poiché quelli che li posseggono provocano malattie più gravi e fungono da antigeni; alcuni hanno il glicocalice. La capsula è costituita prevalentemente da polisaccaridi.
• Flagelli: organi di movimento formati da proteine (flagellina) e sono buoni antigeni H; hanno corpo basale, un uncino e un filamento. Servono per la sierotipizzazione dei ceppi di salmonella patogeni. Si muovono e richiedono ATP. È un movimento chemiotattico orientato a seconda che sia positiva o negativa. Possono essere presenti in numero variabile.
• Pili (o fimbrie): soprattutto nei gram negativi, formati da proteine e riconosciuti dagli antigeni. Mediano l’adesione e la colonizzazione batterica, sono piccole, sottili e sulla porzione esterna (detti pili comuni). Abbiamo poi pili F, detti sessuali, alla base della coniugazione: scambio di materiale genetico tra due cellule. Per arrivare alla cellula il pilo F deve avere il gene che codifica per il pilo ed è sul plasmide (cellula F+) quindi mette a contatto la cellula F+ e F- (senza plasmide).
• Spora batterica: forma di vita del batterio. Cellula batterica inattiva prodotta per poter sopravvivere in alcune circostanze. Funzionamento: la cellula batterica desidera riprodursi, ma può farlo solo in condizioni favorevoli, in altre si trasforma in spora inattiva, può sopravvivere (sporogenesi) e viene chiamata sporangio. I batteri che le producono sono il genere Bacillus e Clostridium (gram positivi). La germinazione è il processo opposto alla sporogenesi: quando le condizioni tornano favorevoli la spora germina e riprende metabolismo e riproduzione. La sporogenesi è riproduzione asimmetrica poiché i primi due passaggi sono uguali alla divisione cellulare: duplicazione DNA, si forma un setto che divide lo sporangio in due compartimenti asimmetrici; la prespora viene inglobata da una 2° membrana con dipicolinato di calcio e peptidoglicano, lisi sporangio, si libera una spora. Questa è formata da: core con cromosoma batterico, poco citoplasma privo di acqua; una corteccia di peptidoglicano, dipicolinato di calcio (è solo nelle spore), una membrana esterna (“mantello”), ultimo strato (“esosporio”). Resistono quindi parecchi anni a T, pH, raggi UV, mancanza di nutrienti. Per la germinazione (90 minuti) è necessario: rottura rivestimenti, entrata H₂O, idratazione, metabolismo e riproduzione.

Riproduzione batterica

Per via asessuata, divisione/fissione binaria: 1 cellula diventa 2. Passaggi della riproduzione:

1. Duplicazione cromosoma batterico
2. Parete batterica si invagina dividendo la cellula in due parti
3. Man mano che si invagina il DNA si ripartisce fra le due cellule
4. Terminata l’invaginazione si ottengono due cellule figlie con uguale corredo cromosomico

Dura 20 minuti/diverse ore. Se non avviene la separazione avremo ad esempio per i cocchi: diplococchi, streptococchi o stafilococchi. Avviene in condizioni favorevoli di pH (in base a batteri acidofili e basofili) e temperatura ottimali, sostanze nutritizie (C, N, P, S, ioni metallici), pressione atmosferica, pressione osmotica e salina. In base alla concentrazione di O₂ nell’ambiente distinguiamo: aerobi obbligati e facoltativi e anaerobi obbligati e facoltativi.

Metabolismo

Le condizioni favorevoli per la riproduzione sono: sostanze nutritizie, temperatura e pH ottimali, pressione, pressione osmotica e pressione salina. A seconda della concentrazione di ossigeno nell’ambiente si distinguono: aerobi obbligati e facoltativi, anaerobi obbligati e facoltativi e microaerofili (crescono se nell’ambiente c’è il 10% di CO₂); tutti i batteri si nutrono di acqua, carbonio, azoto, ioni e energia. Possono essere autotrofi o eterotrofi a seconda che siano in grado di usare CO₂ come fonte di carbonio o necessitano di altre molecole organiche preformate.

Identificazione biochimica dei batteri

• Con l’uso di terreni differenziali: es. terreno di Kliger → osservando i cambiamenti di colore identifichiamo l’organismo contenuto. Incubazione, il microorganismo si moltiplica e inseriamo indicatori per la presenza di cataboliti: con glucosio e lattosio diventa giallo per acidità e rosso per alcalinità, con la produzione di gas rileviamo terreno sollevato, per la produzione di idrogeno solforato ritroviamo annerimento nel fondo.
• Con sistema API 20E: inseriamo in pozzetti diversi substrati (zuccheri/aminoacidi) che l’organismo può usare per il proprio metabolismo; i pozzetti vengono analizzati con spettrofotometro e un computer collegato ci dà la risposta.
• Coltivazione (non sempre necessaria): sono necessari terreni di coltura diversi fra loro per composizione chimica e stato fisico. I terreni possono essere liquidi: brodo di coltura. In beute, provette e bottiglie i microrganismi si moltiplicano, crescono e si valuta l’intorbidimento del terreno ma non comprendo il tipo di organismo presente; quindi li usiamo a scopo di ricerca per ottenere la curva di crescita batterica → si studia come singoli organismi crescono nel tempo; la crescita viene valutata come densità ottica (curva verde) o numero di cellule vive (curva rossa). La curva rossa ha invece:
  1. Fase di latenza: gli organismi non crescono poiché si devono adattare al terreno, poi metabolizzano e sintetizzano gli enzimi inducibili per metabolizzare i nutrienti del terreno
  2. Fase di crescita esponenziale: ad ogni divisione il numero di cellule si duplica
  3. Fase di plateau: quelli che muoiono sono uguali a quelli che si riproducono
  4. Fase di decrescita che tende a 0: finiti i nutrienti non si riproducono e muoiono tutti.
• Oppure solidi: agarizzato per passare da liquido a solido; i microrganismi depositati sulla superficie o in una piastra di Petri per isolare le colonie. Possono essere seminate per striscio con ansa o all’inglese se deposito più cellule insieme. Nella curva di crescita la densità ottica rivela il numero di organismi presenti in coltura sia vivi che morti. I terreni possono essere:
  1. Sintetici: composizione conosciuta e quantificata con carbonio, diazoto, Sali minerali e acqua.
  2. Complessi: i più usati. Non ho una composizione quantificata, aggiungo alla volta i componenti.
  3. Selettivi: con sostanze che favoriscono la crescita di alcuni microrganismi sfavorendone altri.
  4. Differenziale: ha substrati che vengono metabolizzati in maniera diversa dai diversi microrganismi.

Le colonie che si formano possono avere forme diverse: rotonda, filamentosa, irregolare, rizoide. Spesso si usa l’Agar sangue che ci consente di vedere l’attività emolitica dei microrganismi: organismi gamma (no capacità emolitica), alfa emolitici (usano l’emoglobina e la riducono colorando di verde), beta emolitici (hanno emolisine che distruggono eritrociti e usano emoglobina). Sulla base di questi studi abbiamo batteri a crescita rapida che ogni 20 min si replicano e a crescita più lenta che si replicano ogni 24-48h. L’ambiente di crescita può essere chiuso ma anche aperto (chemostato) = aggiungiamo nutrienti e eliminiamo cataboliti continuamente → coltura continua sempre nella fase di crescita esponenziale.

Misura dei microrganismi in un ambiente

Prima si determina se ci sono o meno e nel caso ci fossero vengono anche quantificati quindi si effettua un’analisi qualitativa e quantitativa della coltura. Il conteggio può essere totale o delle cellule vive. Metodiche di analisi quantitativa:

1. Conteggio cellulare
2. Conteggio totale: è il più semplice, contando sia cellule vive che morte su dei vetrini con scanalature sotto alle quali ci sono griglie di conta dove ogni camera ha un certo volume dal quale noi ricaviamo il numero totale di cellule. È molto rapido ma non è selettivo per le sole cellule vive e inoltre è a fresco e si usa un basso ingrandimento.
3. Conteggio vitale: titolazione per diluizione in terreno liquido → diluisco, ne prendo una piccola quantità e la metto in un terreno di coltura a incubare e osserverò poi l’intorbidimento. Alcune cellule intorbidiscono (contengono almeno 1 cellula viva) altre no. Faccio una valutazione statistica. È favorevole perché non dobbiamo contare le colonie è però un metodo indaginoso. Faccio poi la determinazione più probabile con l’uso di tabelle.