Microbiologia

Microbiologia medica e batteriologia

È una scienza che studia i microorganismi, cioè tutti gli esseri unicellulari e i fenomeni correlati. Molti microorganismi che conosciamo vivono in noi e hanno funzioni benefiche. La microbiologia medica studia ciò che provoca delle patologie nell’uomo. La maggior parte dei microorganismi sono procarioti e sono patogeni. La branca che studia i batteri che infettano l’uomo è detta batteriologia. Studia la struttura dei batteri, la crescita e la moltiplicazione dei batteri, la coltivazione, le interazioni tra microorganismo e ospite, i meccanismi di patogenicità, i farmaci antibatterici e la resistenza dei batteri ai farmaci.

Agente eziologico = microorganismo che causa la patologia.

Rapporti tra microorganismo e ospite

I rapporti tra microorganismo e ospite: microorganismo ricava vantaggio e ospite ha solo svantaggi e viene danneggiato; sia ospite che microorganismo hanno vantaggi reciproci; i microorganismi ricevono vantaggio ma ospite non viene danneggiato. Malattia si sviluppa nel rapporto del parassitismo. Il microorganismo entra nel nostro organismo e distrugge cellule e tessuti e causa patologia.

Ci possiamo difendere grazie al nostro sistema immunitario. Difese di superficie contrastano con la penetrazione del microorganismo. Difese interne. Difese innate che sono delle barriere fisiche, muco, mucose, cute. Flussi dilavanti come la saliva, l’urina e le lacrime. pH estremi come l’acidità gastrica che impedisce l’attecchimento dei microorganismi. Patogeni opportunisti sono quelli che diventano patogeni nel momento in cui il nostro sistema immunitario è compromesso, quando le difese del sistema immunitario si abbassano.

Cellula batterica

La cellula batterica è uno degli organismi più piccoli in grado di auto-duplicarsi. Hanno dimensioni ridotte pari a 1 micron e sono organismi unicellulari. Possono essere presenti in varie forme.

• Sferica o ovale: prende il nome di e si suddivide in:
• : Se hanno anche una forma allungata.
• : Rimangono uniti dopo la divisione cellulare.
• Formano un piano di divisione verticale.
• Sono 4 cocchi che rimangono uniti dopo la divisione cellulare e formano due piani di divisione verticali.
• : Otto cocchi che rimangono uniti dopo la divisione cellulare formando 3 piani di divisione, due verticali e uno orizzontale.
• : Cocchi che rimangono uniti dopo la divisione cellulare formando delle catenelle.
• : Rimangono uniti dopo la divisione cellulare formando grappoli irregolari.
• : Hanno una forma a bastoncino.
• Che rimangono uniti dopo la divisione cellulare e sono formati da due bacilli.
• : Rimangono uniti dopo la divisione cellulare e formano catenelle.
• : Forma a virgola.
• : Forma a spirale.

Si possono vedere al microscopio ottico a immersione.

La cellula procariote è priva di organelli citoplasmatici ma presenta strutture obbligatorie: nucleoide, citoplasma, membrana citoplasmatica, mesosomi, solo nei Gram positivi, parete cellulare e presenta strutture facoltative come strato mucoso, capsula o glicocalice, flagelli o cilia, pili e fimbrie.

Nucleoide e citoplasma

La cellula batterica è priva di nucleo, quindi il materiale genetico, cioè una molecola circolare di DNA a doppia elica si trova raggomitolato nel citoplasma e non è delimitato da involucro nucleare. Il DNA si trova complessato con una serie di proteine dette girasidi tipo II che svolgono una funzione strutturale o regolatoria dell’espressione genica, quindi permettono il superavvolgimento del cromosoma. Questo complesso DNA-proteine prende il nome di nucleoide. Il DNA nel nucleoide lega molte poliammine, neutralizzano il pH acido dell’acido nucleico e lo proteggono da variazioni nella temperatura.

Non ha la mitosi ma si riproducono per scissione binaria.

Il citoplasma è una massa granulare in cui sono presenti varie sostanze in quantità differenti a seconda della specie batterica:

• Glicogeno presente come materiale di riserva.
• Lipidi.
• Polisaccaridi e amilopectine.

Sono presenti come delle vere e proprie entità: che a causa dell’assenza del reticolo endoplasmatico si associano alla membrana citoplasmatica dove si trovano anche tutti gli enzimi respiratori e le fonti energetiche. Hanno una dimensione di 70S che sono molecole circolari di DNA extra-cromosomico libere nel citoplasma.

Membrana plasmatica

La cellula batterica presenta una membrana plasmatica caratterizzata da una struttura trilaminare, cioè costituita da un doppio strato fosfolipidico. I fosfolipidi sono molecole anfipatiche per cui tendono a rivolgere le teste polari verso l’esterno a contatto con l’acqua e le code apolari si fronteggiano in modo tale da rivolgere la minor superficie all’acqua. Inserite nella membrana sono presenti proteine, è invece assente il colesterolo ma in alcuni procarioti sono presenti molecole simili al colesterolo che svolgono la stessa funzione e sono gli . Servono a stabilizzare la membrana e a renderla più rigida.

È una membrana semipermeabile perché presenta proteine di vario tipo che permettono il passaggio di varie sostanze in modo selettivo e permettono di mantenerle e conservarle nel citoplasma.

Le proteine di membrana svolgono molte funzioni.

• I trasportatori o permeasi sono delle proteine che permettono il passaggio di sostanze attraverso la membrana. Questo trasportatore può fare un tipo di trasporto che prende il nome di uniporto se trasporta una sola sostanza attraverso la membrana, simporto quando trasporta contemporaneamente due molecole attraverso la membrana, entrambe nella stessa direzione e antiporto se trasporta due molecole attraverso la membrana in direzioni opposte.

Il trasporto semplice è controllato dall’energia associata dalla forza promotrice. La traslocazione di gruppo è un tipo di trasporto durante il quale la sostanza che deve attraversare la membrana viene modificata chimicamente e viene controllata dal fosfoenolpiruvato. Il sistema ABC è un tipo di trasporto che utilizza proteine periplasmatiche, cioè una proteina transmembrana che funziona da canale di trasporto e un terzo componente citoplasmatico che fornisce l’energia necessaria, ottenuta dall’idrolisi dell’ATP.

Altre proteine di membrana possono essere quelle coinvolte nella replica del cromosoma, enzimi, altri enzimi deputati alla secrezione delle proteine, tossine coinvolte nella biosintesi di altre strutture cellulari come parete e flagelli, proteine per il metabolismo energetico, e sensori per parametri ambientali.

Le proteine di membrana coinvolte nel metabolismo energetico sono quelle che creano un gradiente protonico di membrana, quindi una differenza di potenziale tra interno ed esterno. L’interno sarà debolmente negativo mentre l’esterno sarà debolmente positivo. Questo gradiente protonico di membrana viene trasformato in ATP dal complesso ATPasi. È una proteina associata alla membrana. Il complesso ATPasi ha dei canali per far passare p+, li apre e li fa passare attraverso la membrana. Altre proteine di membrana possono essere sensori ambientali.

La cellula batterica risponde agli stimoli esterni sfruttando proteine di membrana. Sono dei sistemi a due componenti, cioè sensore più regolatore che servono per trasdurre il segnale. Il segnale arriva alla proteina che prende il nome di sensore o Kinasi, vi si lega e grazie alla fosforilazione dell’ATP e all’aggiunta di un gruppo P al sensore, questo cambiando conformazione permette il passaggio della molecola segnale attraverso la membrana e poi associandosi al regolatore e permette l’attivazione o la repressione dell’espressione genica.

I batteri possono essere coltivati in laboratorio, vengono usate piastre tetra che contengono terreni di coltura ricchi di sostanze nutritive che permettono alle cellule di crescere e replicarsi. Contengono colonie di batteri che aggregate diventano visibili.

Parete cellulare batterica

La parete cellulare è uno dei componenti essenziali dei batteri e costituisce la struttura più esterna. Conferisce stabilità alla cellula e ne mantiene la forma, infatti se si elimina la parete con il lisozima un batterio bastoncellare diventerebbe sferico, contiene delle strutture con le quali interagisce il nostro sistema immunitario ed è sede di vari fattori di virulenza e patogenicità. Serve inoltre per controbilanciare la pressione osmotica.

Normalmente i batteri negli ambienti naturali non si trovano in condizioni isotoniche, cioè condizioni in cui la concentrazione di soluti all’esterno è uguale a quella all’interno della cellula. I batteri si possono trovare in ambiente ipotonico o ipertonico e senza la parete cellulare la cellula batterica subirebbe una lisi.

• Nell’ambiente ipotonico la concentrazione di soluti all’esterno della cellula è inferiore rispetto all’interno della cellula. Dato che tende all’equilibrio, per far diminuire la concentrazione di soluti fanno entrare acqua nella cellula. Se la parete però non controbilancia, la cellula scoppia.
• Nell’ambiente ipertonico la concentrazione di soluti è superiore all’esterno per cui per raggiungere l’equilibrio l’acqua deve fuoriuscire dalla cellula, se la parete non controbilancia, la cellula collassa.

In alcuni casi possiamo rompere la parete senza far morire la cellula, basta mettere la cellula in una soluzione isotonica. Per esempio una soluzione al 20% di saccarosio. Se però la parete viene distrutta si ha un rigonfiamento nel citoplasma e la distruzione della parete porta alla formazione di elementi sferici detti sferoplasti e protoplasti a seconda che servino o meno un frammento di parete.

La parete batterica è la struttura che risponde meglio ai coloranti utilizzati nelle colorazioni che vengono utilizzate a scopo diagnostico, questo perché queste sostanze reagiscono con componenti della parete batterica. La composizione della parete ci permette di classificare i batteri che infettano l’uomo.

• Uno dei tipi di batteri che infettano l’uomo può essere classificato in batteri Gram+ e Gram-.
• Un altro tipo di batteri che infettano l’uomo possono essere i micobatteri che non rientrano nella classificazione dei Gram perché hanno una parete con caratteristiche diverse. Questi batteri vengono colorati con la colorazione di Ziehl-Neelsen.
• Altri batteri hanno una parete diversa rispetto a quella degli altri due gruppi, che però non viene riconosciuta con particolari colorazioni, micoplasmi, clamidie, altre classi batteriche.

La cellula batterica al microscopio elettronico è vista come uno strato omogeneo e denso agli elettroni nel Gram+ mentre nei Gram- ha un aspetto pluristratificato. Questo perché hanno una diversa composizione strutturale.

Peptidoglicano

La parete cellulare è costituita prevalentemente da peptidoglicano, una componente esclusiva dei batteri che non troviamo nelle cellule eucariote e che non si trovano nemmeno negli archeobatteri e nei micoplasmi. Ci possono essere più strati di peptidoglicano uno sopra all’altro come nel caso dei Gram+, oppure la parete batterica può essere fatta da un singolo strato di peptidoglicano e ricoperta da membrana esterna come nel caso dei Gram-. Questo nome deriva dalla diversa capacità della parete batterica di reagire con i coloranti e che ci permette di distinguere i batteri dei due generi.

Le due tipologie di batteri si colorano in maniera diversa e questo è dovuto alla diversa struttura della parete batterica.

Colorazione di Gram

La procedura è la seguente: si prepara uno striscio su un vetrino e si fissa la cellula batterica sul vetrino, lo faccio asciugare all’aria e poi uso il calore per fissare il campione. Posso poi ricoprire il vetrino con le soluzioni coloranti e osservare al microscopio.

• Dopo di che coloro la coltura batterica con un primo colorante che è il cristal violetto, di colore violetto.
• Fisso il colorante alla parete batterica con una soluzione iodoiodurata detta “lugol”.
• Eseguo una breve decolorazione utilizzando dell’alcool.
• I batteri Gram+ che fissano il colorante bene non si decolorano, mentre i Gram- si decolorano.
• I Gram+ saranno colorati in violetto mentre Gram- saranno decolorati e saranno incolore.
• Eseguo una contro-colorazione con un colorante diverso e dal colore diverso, cioè la fucsina che colora solo i Gram-, saranno rossi.

Tutto questo avviene perché il cristal-violetto è carico positivamente e va a legarsi con le strutture cariche negativamente del peptidoglicano. La iodina invece forma grossi complessi con il cristal-violetto. L’alcol e l’acetone agiscono su fosfolipidi di membrana per cui rimuove il colorante.

Questa colorazione è molto importante dal punto di vista diagnostico per l’analisi di un campione prelevato da un sito sterile, es: liquido cefalorachidiano. In un paziente con meningite questo campione non sarà più sterile e questo lo si può vedere con una colorazione di Gram che deve essere eseguita in modo rapido. È importante infatti stare attenti ai tempi in cui avvengono tutti questi processi di colorazione perché la diagnosi deve avvenire in modo rapido.

Meningite e liquor

Per esempio nel caso delle meningiti, che sono delle infezioni delle meningi, quest’infezione è presente anche nel liquido cefalo-rachidiano. Le meningiti si gonfiano e si hanno i sintomi: febbre, mal di testa. Possono entrarvi batteri a causa di traumi e infezioni.

Per fare la diagnosi si preleva il liquor tramite l’esame della rachicentesi. Dovrò fare una puntura lombare. Il liquor verrà portato in laboratorio dove viene centrifugato per raccogliere le cellule, poi verrà allestito lo striscio per la colorazione di Gram e verrà osservato al microscopio. È molto importante sapere se un batterio è Gram+ o Gram- perché devo decidere quale antibiotico usare.

Se il liquor è limpido, chiamato anche “acqua di fonte”, allora l’infezione sarà virale. Infatti osservando al microscopio si possono osservare cellule mononucleate, le proteine aumentano di poco e la quantità di glucosio rimane uguale. Le meningiti virali sono meno gravi e meno rapide.

Se il liquor è torbido la meningite sarà di origine batterica e aumentano le cellule del sistema immunitario, in particolar modo i neutrofili, aumentano in modo consistente le proteine, faccio l’analisi non solo sulle cellule del liquor ma anche su quelle batteriche, quindi il numero di proteine aumenta, e cala la quantità di glucosio.

Struttura della parete

La parete batterica è una struttura rigida, compatta, simile a una rete formata da catene polisaccaridiche lineari, unite grazie a legami crociati di natura peptidica, quindi formata prevalentemente da peptidoglicano. Il peptidoglicano è costituito da due componenti fondamentali. Una componente glicanica e una lipidica.

I costituenti fondamentali del peptidoglicano, detto anche mucopeptide, mureina o glicopeptide, sono due amminozuccheri acetilati: N-acetilglucosammina e acido N-acetilmuramico. NAG e NAM formano la porzione polisaccaridica detta anche glicano e sono uniti da un legame B1,4-glucosidico, il carbonio in posizione 1 dell’NAM lega quello in posizione 4 del NAG. Formano catene che vanno dalle 10 alle 80 unità disaccaridiche ripetute. Le catene polimeriche si affiancano l’uno all’altro in modo tale da formare le catene glicaniche.

Se fosse solo questa la struttura la parete non sarebbe abbastanza rigida né abbastanza resistente per garantire le funzionalità della parete stessa. Per fare questo esiste la componente peptidica. Al NAM è legata una catena peptidica formata da 4 aminoacidi, chiamato ramoscello tetrapeptidico: L-alanina, acido D-glutaminico, L-lisina e D-alanina.

Le catene individuali di peptidoglicano si trovano adiacenti e sono tenute insieme a livello dei tetrapeptidi attraverso legami crociati peptidici. Il legame peptidico crociato tra diaminoacido in posizione 3 e D-alanina in posizione 4 può essere indiretto, quindi mediante un ponte pentaglicinico, Gram+, formato da 5 glicine, questo legame prende il nome di transpeptidico, oppure diretto mediante legame peptidico tra acido diaminopimelioco e D-alanina, Gram-.

Il numero di legami crociati è diverso tra batteri Gram+ e Gram-: nei primi tutti i residui dell’acido N-acetilmuramico sono legati a una catena tetrapeptidica a formare una parete rigida molto forte. Nei secondi i legami sono più scarsi. Gli enzimi che determinano la formazione dei legami trasversali si chiamano transpeptidasi e vengono inibiti dagli antibiotici della famiglia delle penicilline.

Acidi teicoici e lipoteicoici

Il peptidoglicano dei batteri Gram+ è più complesso e presenta strutture antigenicamente diverse, intercalate nello spazio di peptidoglicano: acidi teicoici e lipoteicoici. Sono diverse da specie a specie. La variabilità genetica dei batteri Gram+ è garantita da queste strutture intercalate che sono polimeri di polialcol, legati a una porzione lipidica.

Gli acidi teicoici sono polimeri di glicerolofosfato, sono solubili in acqua e sono legati covalentemente al peptidoglicano, svolgono una funzione di adesione, sono altamente antigenici e sono importanti fattori di virulenza. Si legano direttamente con il peptidoglicano, sono legati covalentemente e si intercalano nel molteplice strato del peptidoglicano dei Gram+.

Gli acidi lipoteicoici possono essere secreti o rilasciati nel terreno di coltura e nell’uomo e anche se più debolmente possono svolgere attività endotossica. Hanno una molecola di acido grasso tramite la quale si legano direttamente alla membrana plasmatica. Contribuiscono a dare una stabilità strutturale alla parete batterica. Funziona da antigene, sia perché può essere riconosciuto dal nostro sistema