Microbiologia

MICROBIOLOGIA

Sterilizzazione e Disinfezione — discorso completo (libro + lezione)

In un laboratorio di microbiologia lavorare in sterilità è un requisito imprescindibile: ogni semina deve essere effettuata

in un ambiente sterile, perché la presenza di microrganismi contaminanti potrebbe falsare i risultati o addirittura

compromettere l’identificazione del germe in esame.

Per sterilizzazione si intende il processo che porta alla totale eliminazione di ogni forma vivente presente nel

materiale trattato — batteri, spore comprese, miceti, virus, parassiti — senza distinguere tra organismi patogeni e

saprofiti. Le spore meritano una menzione particolare: sono involucri che alcuni batteri formano in condizioni

ambientali sfavorevoli (carenza di nutrienti, disagio ambientale) per proteggersi, e rappresentano la forma di vita più

resistente da eliminare — è proprio la loro eliminazione a segnare il confine netto tra sterilizzazione e disinfezione.

Con la sterilizzazione si ottiene infatti l’asepsi, cioè l’assenza totale di ogni microrganismo vivente, e il materiale

trattato viene definito asettico o sterile.

Per disinfezione, al contrario, si intende il processo che elimina i batteri patogeni, ma non le spore: porta quindi

all’uccisione della maggior parte dei microrganismi, senza garantire la completa eliminazione di ogni forma vivente.

La differenza-chiave da dire subito, se la prof chiede “qual è la differenza tra le due”: la sterilizzazione è un processo

assoluto e indiscriminato (tutto muore, comprese le spore), la disinfezione è un processo parziale e mirato ai

patogeni, che non garantisce l’eliminazione delle spore.

i METODI STERILIZZAZIONE

I metodi per la sterilizzazione si dividono in fisici (calore secco, calore umido, radiazioni, filtrazione) e chimici

(disinfettanti, antisettici, come ossido di etilene, glutaraldeide, formaldeide, perossido di idrogeno).

Calore secco

Utilizza la stufa a secco (o forno Pasteur), che sterilizza vetreria e materiale in acciaio tramite due termostati

indipendenti — uno per la temperatura, uno per il tempo. I parametri tipici sono 160°C per 2 ore oppure 170°C per 1

ora. Il calore secco ha un basso potere penetrante, a causa della scarsa conducibilità termica dell’aria, per questo

servono temperature più alte e tempi più lunghi rispetto al calore umido. Non è adatto per materiali termolabili

(gomma, plastica) né per terreni di coltura. Un dispositivo complementare, per la sterilizzazione rapida di piccoli

strumenti come l’ansa di platino, è la fiamma diretta del becco Bunsen: crea un’area di aria completamente sterile

intorno a sé, permettendo di lavorare anche senza cappa.

Calore umido

Molto più efficace del secco, grazie alla maggiore conducibilità termica dell’acqua. Lo strumento cardine è l’autoclave:

funziona tramite vapore sotto pressione, raggiungendo 121°C per 15 minuti — parametri più bassi rispetto alla stufa a

secco proprio perché il vapore acqueo è un conduttore termico molto migliore, capace di uccidere i microrganismi

coagulando e denaturando le proteine. È indicata per vetreria, metalli, gomma, ma non per materiali termolabili

(plastica). Il ciclo prevede: innalzamento della temperatura fino a 121°C, mantenimento per 15 minuti, sfiato graduale,

apertura della valvola solo dopo che tutto il vapore sotto pressione è uscito e il materiale si è raffreddato.

Un’osservazione importante: il vapore fluente semplice (come nella pentola di Koch, max 100°C) elimina batteri, miceti

e virus ma non le spore; per eliminare anche le spore con vapore non pressurizzato serve la tindalizzazione

(sterilizzazione frazionata): riscaldamento a 85°C per 1 ora, ripetuto per 3 giorni consecutivi, alternato a incubazione a

35°C per 24 ore, in modo da uccidere prima le forme vegetative e poi, dopo la germinazione indotta delle spore residue,

eliminare anche queste ultime nei cicli successivi. È usata per materiali termolabili come latte, siero, tuorlo d’uovo.

tindalizzazione è una sterilizzazione frazionata. Si esegue un riscaldamento, classicamente

intorno ai 100 °C, seguito da un periodo di incubazione durante il quale le eventuali spore

germinano; poi si riscalda nuovamente. Il procedimento viene ripetuto per più giorni.

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Radiazioni — sterilizzazione “a freddo”

• UV (non ionizzanti): scarso potere penetrante, inducono dimeri di timina nel DNA causando mutazioni letali;

non eliminano le spore; usate per sale operatorie e laboratori.

• Raggi gamma (ionizzanti): forte potere penetrante, letali per qualsiasi forma di vita; usati per materiale

monouso (siringhe, capsule Petri).

• Raggi X: pur essendo letali e ad alto potere penetrante, non vengono usati per costi elevati e perché le

radiazioni sono emesse in tutte le direzioni dalla sorgente, rendendo il processo poco efficiente.

Filtrazione

Non uccide i microrganismi, ma li separa fisicamente tramite membrane filtranti — indispensabile per sostanze

liquide termolabili (siero, antibiotici, zuccheri). Lo stesso principio è alla base dei filtri HEPA utilizzati nelle cappe

da laboratorio (vedi sotto), che trattengono particelle di diametro ≥0,3 micron.

STERILIZZAZIONE CON MEZZI CHIMICI

Sostanze antimicrobiche come aldeidi e ossido di etilene— utilizzate tipicamente per disinfettare piani di lavoro e

strumenti che non tollerano il calore.

Il controllo della sterilizzazione

Dopo aver sterilizzato il materiale in autoclave o in stufa, è necessario verificare che il processo sia avvenuto

correttamente, tramite due tipi di indicatori:

• Indicatori chimici: nastri adesivi o cartine tornasole imbevute di sostanze specifiche, applicate su beute o

cassettine metalliche, oppure poste direttamente dentro l’autoclave/stufa. Se la sterilizzazione è avvenuta

correttamente si osserva un viraggio di colore.

• Indicatori biologici: spore di Bacillus subtilis per il controllo del calore secco, e spore di Bacillus

stearothermophilus per il calore umido. Le spore, essendo le forme di vita più resistenti in assoluto,

rappresentano il test più rigoroso: se non sopravvivono nemmeno loro, la sterilizzazione è garantita al massimo

livello.

Le cappe — un presidio complementare alla sterilizzazione

Le cappe permettono di lavorare in sterilità grazie a un sistema di ventilazione che aspira l’aria contaminata dalla

postazione di lavoro, facendola passare attraverso filtri HEPA (composti da foglietti filtranti di microfibra, assemblati

con setti di alluminio), capaci di bloccare particelle e batteri con diametro ≥0,3 micron. Sotto cappa non si utilizza mai

il becco Bunsen, perché la fiamma danneggerebbe i filtri, compromettendo la sterilità; per lo stesso motivo bisogna

sempre indossare i guanti, e i filtri richiedono manutenzione ogni 6 mesi.

Esistono diversi tipi di cappa, distinti in base al flusso d’aria:

• Cappa a flusso orizzontale: priva di specchio, completamente aperta; l’aria attraversa un piano metallico e

arriva direttamente in faccia all’operatore. Protegge solo il materiale (l’aria in uscita è sterile), ma non

l’operatore, che resta esposto — per questo si può usare solo con materiale già sterile (es. preparazione di

terreni), mai con campioni potenzialmente contaminati.

• Cappa a flusso verticale (di sicurezza biologica, II classe): chiusa, dotata di specchio e di due filtri (uno in

ingresso, uno in uscita). Circa il 30% dell’aria esce verso l’esterno, il restante 70% ricircola internamente

passando attraverso i filtri. Protegge sia l’operatore sia il campione, poiché l’aria entra dall’alto attraverso un

piano forato, investe il materiale senza permettere ai microrganismi di risalire verso l’operatore, e viene

comunque ripulita dai filtri prima di essere rilasciata nell’ambiente.

• Cappe chimiche: più grandi, con forte potere aspirante, usate per colorazioni con sostanze tossiche o

cancerogene, a tutela della sicurezza dell’operatore (non della sterilità del campione).

A fine giornata la cappa va lasciata pulita e disinfettata, chiusa con gli appositi coperchi, e si accendono gli UV per

un’ulteriore decontaminazione.

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Come avviene la disinfezione

Il mezzo con cui si realizza

La disinfezione si realizza attraverso l’uso di composti chimici, che possono essere di due tipi, distinti in base

alla modalità d’uso:

• Antisettici: usati sui tessuti vivi (cute, mucose)

• Disinfettanti: usati su oggetti inanimati (superfici, strumenti), per la loro maggiore tossicità

cellulare

Una stessa sostanza può funzionare sia da antisettico sia da disinfettante, semplicemente variando la

concentrazione d’uso — un dettaglio utile se la prof chiede la differenza tra i due termini.

Come si graduano gli effetti — i tre livelli

La disinfezione non è un processo unico e uniforme: si può ottenere a tre livelli di efficacia (alto, medio,

basso), a seconda della sostanza chimica scelta e della resistenza del microrganismo bersaglio:

• Livello alto: sostanze come ossido di etilene, glutaraldeide, formaldeide, perossido di

idrogeno. Usate per strumenti medici invasivi che non tollerano il calore (endoscopi, strumenti chirurgici in

plastica). Alcune di queste, come le aldeidi, arrivano a eliminare anche le spore, avvicinandosi molto all’efficacia

di una vera sterilizzazione.

• Livello medio: sostanze come i composti fenolici (es. clorexidina) e gli alogeni (composti del

cloro, iodofori). Usate su superfici o oggetti a basso rischio di contaminazione sporale.

• Livello basso: composti dell’ammonio quaternario e alcoli. Usati su strumenti a contatto

solo con la cute (elettrocardiografi, sfigmomanometri).

I meccanismi d’azione — perché funzionano

Ogni classe di sostanze agisce in modo diverso a livello molecolare:

• Ammonio quaternario: altera la membrana citoplasmatica, denatura le proteine

• Alcoli: denaturano le proteine, alterano la parete cellulare

• Fenoli: alterano la membrana citoplasmatica

• Alogeni: inattivano le proteine (enzimi) a livello dei gruppi -SH

Il principio generale è che il meccanismo d’azione determina lo spettro di attività: le sostanze che agiscono solo sulla

membrana (ammonio quaternario, alcoli) hanno effetto limitato — non toccano le spore, non toccano i virus nudi (privi di

envelope); le sostanze che invece danneggiano direttamente acidi nucleici e strutture proteiche profonde (aldeidi, ossido

di etilene, perossido di idrogeno) riescono a colpire anche le forme più resistenti come le spore, arrivando quindi a un livello

di disinfezione “alto”.

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CAPITOLO 1

I tre domini: Bacteria, Archaea, Eukarya (paragrafo introduttivo)

L’origine della vita risale a circa 4 miliardi di anni fa, con la comparsa dei procarioti — gli organismi unicellulari più

semplici comparsi sulla Terra. Le successive fasi evolutive, prima dei procarioti, poi degli eucarioti unicellulari e infine

degli eucarioti multicellulari, rappresentano uno dei problemi biologici più affascinanti e complessi da ricostruire. La

classificazione tassonomica degli organismi monocellulari, insieme allo studio dei loro rapporti evolutivi, ha contribuito

in modo determinante a delineare la comparsa e la diffusione della vita sulla Terra.

Prima di entrare nel merito della classificazione vera e propria, è utile definire cos’è la tassonomia: è quella parte della

scienza che si occupa di ordinare in modo sistematico e di denominare in maniera univoca gli organismi biologici.

Storicamente, gli organismi viventi sono stati suddivisi in cinque Regni, individuati sulla base delle loro proprietà

fenotipiche. Tuttavia, gli studi molecolari condotti negli ultimi decenni — in particolare quelli sulla struttura dei geni

dell’RNA della subunità piccola dei ribosomi — hanno smentito questa classificazione tradizionale, dimostrando che

non esistono realmente cinque linee evolutive fondamentali.

Oggi, quindi, gli organismi viventi vengono suddivisi in tre sole linee evolutive, denominate domini. Di questi tre

domini, due raggruppano i procarioti — Bacteria e Archaea — mentre il terzo raggruppa gli eucarioti — Eukarya.

LE DIFFERENZE TRA BACTERIA, ARCHAEA ED EUKARYA

Una volta stabilito che esistono tre domini, è fondamentale conoscere le caratteristiche che li differenziano.

Partiamo dall’organizzazione cellulare:

- sia i Bacteria sia gli Archaea sono organismi esclusivamente unicellulari

- mentre il dominio Eukarya comprende sia forme unicellulari sia forme pluricellulari esempio lieviti e molti

protozoi sono unicellulari.

Il criterio più classico e più immediato per distinguere procarioti ed eucarioti riguarda il nucleo:

- sia BACTERIA SIA ARCHAEA sono privi di un nucleo circondato da membrana — il loro materiale

genetico è libero nel citoplasma.

- Solo gli organismi del dominio EUKARYA possiedono un vero nucleo, avvolto dalla membrana nucleare.

Un’altra differenza fondamentale riguarda la presenza degli organuli cellulari.

- I Bacteria e gli Archaea, essendo organismi procarioti, non possiedono organuli delimitati da membrana:

quindi non presentano un vero nucleo, né mitocondri, reticolo endoplasmatico o apparato di Golgi.

- Gli Eukarya, invece, possiedono una maggiore compartimentalizzazione interna, con un nucleo delimitato da

membrana e diversi organuli membranosi, come mitocondri, reticolo endoplasmatico e apparato di Golgi.

I ribosomi sono invece presenti in tutti e tre i domini, anche se differiscono per struttura e dimensioni.

Per quanto riguarda la struttura del cromosoma

- BACTERIA E ARCHAEA condividono un cromosoma di forma circolare

- mentre negli EUKARYA il cromosoma è lineare.

Un’altra caratteristica condivisa tra i due domini procariotici è la presenza di plasmidi, molecole di DNA accessorie

rispetto al cromosoma principale — presenti sia nei Bacteria sia negli Archaea, ma completamente assenti negli

Eukarya.

Qui arriva un dato particolarmente interessante, che vale la pena sottolineare perché mostra come non sempre la linea di

demarcazione coincida semplicemente con “procarioti da un lato, eucarioti dall’altro”: parlando delle proteine

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associate al cromosoma, i Bacteria ne sono completamente privi, mentre sia gli Archaea sia gli Eukarya

possiedono proteine specifiche chiamate istoni, associate al proprio DNA. Su questo aspetto specifico, quindi, gli

Archaea si avvicinano molto di più agli eucarioti che ai batteri — un elemento che ha contribuito storicamente a far

riconoscere gli Archaea come un dominio a sé stante, distinto dai Bacteria.

Anche i lipidi di membrana presentano differenze chimiche precise.

- In Bacteria ed Eukarya, il glicerolo che costituisce i fosfolipidi di membrana è legato ad acidi grassi

lineari — negli Eukarya, in aggiunta, sono presenti anche steroli.

- Negli Archaea, invece, il glicerolo è legato ad acidi grassi ramificati — una peculiarità biochimica del tutto

esclusiva di questo dominio, che li rende straordinariamente resistenti alle condizioni ambientali estreme.

Per quanto riguarda il PEPTIDOGLICANO, componente strutturale della parete cellulare, esso è presente SOLO NEI

BACTERIA. È completamente assente sia negli Archaea sia negli Eukarya: quando questi ultimi possiedono una parete

cellulare — come nel caso di funghi e piante — questa è costituita rispettivamente da chitina o da cellulosa, materiali

strutturalmente diversi dal peptidoglicano batterico.

Anche l’inizio della traduzione proteica distingue i tre domini a livello molecolare:

- nei Bacteria, il primo aminoacido incorporato è sempre la formilmetionina;

- in Archaea ed Eukarya, invece, la traduzione inizia con la semplice metionina — un’ulteriore conferma di

come, dal punto di vista dei meccanismi genetici fondamentali, gli Archaea condividano più caratteristiche con

gli eucarioti che con i batteri.

Infine, per quanto riguarda l’habitat, tutti e tre i domini hanno una distribuzione ubiquitaria sulla Terra, ma gli

Archaea presentano una particolarità importante: sono gli unici organismi capaci di colonizzare ambienti estremi —

sorgenti idrotermali ad altissima temperatura, ambienti fortemente acidi o alcalini, concentrazioni saline elevatissime —

dove nessun altro organismo vivente riuscirebbe a sopravvivere.

Un punto conclusivo, molto importante dal punto di vista medico

Il dominio Archaea comprende solamente tre phyla — Crenarchaeota, Euryarchaeota e Korarchaeota — a fronte di

almeno cinquanta phyla conosciuti nel dominio Bacteria. Gli Archaea sono microrganismi esclusivamente ambientali,

e va sottolineato con chiarezza un dato fondamentale per un corso di microbiologia medica: questo dominio non

contiene alcun patogeno umano noto. Tracce del loro RNA ribosomiale 16S sono state rinvenute negli ambienti più

disparati — oceani, laghi, suolo, persino i ghiacci dell’Antartide — a testimonianza della loro straordinaria capacità di

adattamento, ma mai in un contesto di malattia infettiva umana.

Chiudiamo con un’ipotesi evolutiva affascinante: si ritiene oggi che gli organismi del dominio Eukarya siano derivati

dalla fusione di Bacteria e Archaea diversi nel corso dell’evoluzione. Gli eucarioti conterrebbero infatti, nel proprio

genoma, geni originariamente propri di entrambi i domini procariotici: in particolare, gli Archaea avrebbero contribuito

con i caratteri implicati nei meccanismi genetici fondamentali — coerentemente con quanto visto per istoni e inizio

della traduzione — mentre i Bacteria avrebbero contribuito soprattutto con caratteri legati ai processi metabolici.

TASSONOMIA (domanda) Cos’è la tassonomia

La tassonomia è quella parte della scienza che si occupa di ordinare in modo sistematico e di denominare in maniera

univoca gli organismi biologici. All&rsq