Metodologia diagnostica in microbiologia clinica

Lez. 1 microbiologia clinica, Marchetti: antibiotici

Un antibiotico è una sostanza che viene prodotta naturalmente da microrganismi e capace di agire su altri microrganismi, attraverso 2 azioni: inibendone la crescita (azione batteriostatica) o distruggendoli (distruggendo la cellula batterica o i microrganismi in questione) (azione battericida).

Queste molecole sono dei metaboliti secondari, ovvero sono delle sostanze che di per sé non contribuiscono alla sopravvivenza di tale microrganismo in condizioni fisiologiche, ma sono sostanze che vengono prodotte in risposta ad una problematica o ad una alterazione dell’ambiente esterno, un’alterazione tale che propone una risposta di attacco-fuga nei confronti del microrganismo. È importante sapere che hanno un effetto solo contro i microrganismi e i batteri. Non hanno effetto contro i virus.

Scoperta dei primi antibiotici

L’inizio dell’era degli antibiotici viene fatta coincidere con la data del 1928, la scoperta della penicillina da parte di Alexander Fleming.

Alone di inibizione: alone circostante ad una sostanza che inibisce la crescita batterica.

Nel 1910 era stata scoperta e iniziata a commerciare il salvarsan, un metabolita che era stato ottenuto dall’arsenico, quindi è un derivato dell’arsenico e fu il primo antibiotico che venne utilizzato, però essendo ottenuto da una sintesi chimica, partendo da un derivato dell’arsenico, più che come un antibiotico venne riconosciuto come un chemioterapico.

Se abbiamo un antibiotico che è stato creato in laboratorio viene definito chemioterapico.

Il salvarsan, essendo un derivato dell’arsenico, aveva molte problematiche, aveva bisogno di un quantitativo di concentrazione molto alto e poi aveva una serie di effetti avversi, ma era l’unica arma a disposizione.

Insorgenza dell’antibiotico-resistenza

Insorgenza dell’antibiotico-resistenza → ovvero una resistenza/insensibilità nei confronti dell’antibiotico.

1948: viene riportata la prima resistenza alla penicillina nello stafilococco.

Caratteristiche degli antibiotici

Quali sono le caratteristiche principali che un antibiotico deve avere per essere identificato come tale?

1. Deve essere una sostanza che esplichi il suo effetto massimo sulla cellula batterica e non deve interferire in alcun modo con la cellula umana.
2. L’attività metabolica o la struttura con cui entra in contatto, su cui esplica la sua azione, deve essere tipicamente batterica e deve differire in maniera significativa con quelle che sono della cellula umana.
3. Le molecole ad attività antibiotica o chemioterapica agiscono sfruttando queste differenze.

Importante: tutti i farmaci antibatterici agiscono inibendo una determinata via metabolica, per cui sono attivi solo nei confronti di batteri attivamente metabolizzanti.

Questo vuol dire che se uso un antibiotico che va ad es. ad intaccare la parete cellulare batterica, questo antibiotico non andrà ad intaccare quei batteri che hanno già la loro parete formata e finita, ma andrà ad agire su quei batteri che stanno formando in quel momento la loro parete batterica.

Un antibiotico per poter esplicare la sua attività antibatterica deve essere in grado di:

• Entrare nella cellula batterica e raggiungere il sito d’azione.
• Legarsi fisicamente al bersaglio, che è coinvolto in un processo essenziale per la vitalità cellulare.
• Inibire il processo in cui il bersaglio svolge un ruolo fondamentale.
• Non essere modificato all’interno della cellula, altrimenti siamo davanti ad un caso di inattivazione dell’antibiotico (molto importante).

1

Come possiamo classificare gli antibiotici?

Nel corso degli anni da quando sono stati scoperti ci sono state varie classificazioni, in figura sono riportate le 4 principali. Una molto utilizzata è quella in base allo spettro d’azione.

MIC = minima concentrazione inibente, tale per cui si ha il blocco della sintesi batterica, ovvero i batteri a questa concentrazione di antibiotico non potranno più riprodursi.

MBC = minima concentrazione battericida, che rappresenta la concentrazione di antibiotico tale per cui si procura la morte del m.o.

Un’altra classificazione è in base all’origine dell’antibiotico, i primissimi antibiotici come per es. la penicillina sono di natura estrattiva, cioè sono stati naturalmente estratti da m.o. come batteri o funghi.

Semisintetica: parto da una molecola di natura estrattiva a cui vengono aggiunte delle molec. che possono essere delle unità saccaridiche, lipidi o altro che vada ad enfatizzare, aumentare la portata dell’antibiotico.

Quando si parla di sintesi chimica si è davanti ad una creazione in laboratorio della molecola antibiotica o antimicrobica.

Sia MIC che MBC: unità di misura microgrammo per ml.

Principali antibiotici a carattere battericida e batteriostatico:

• Battericidi da ricordare: penicilline, cefalosporine, carbapenemi e monobattami, questi 4 fanno parte della fam. dei beta-lattamici e la fosfomicina.
• Batteriostatici da ricordare: macrolidi e tetracicline.

2

Classificazione degli antibiotici in base al bersaglio

Antibiotici che agiscono sulla parete cellulare

La parete cellulare dei m.o. è caratterizzata dalla presenza del peptidoglicano, che è una struttura polisaccaridica che è formata dalle ripetizioni di unità disaccaridiche, formata dalle molecole NAG (N-acetil Glucosammina) e NAM (N-acetil muramico).

Quali sono le differenze tra la parete dei gram + e -? In quella dei gram - si hanno 2 membrane cellulari, una interna ed una esterna e in mezzo alle 2 si ha un sottile strato di peptidoglicano. Nei gram + si ha una sola membrana cellulare interna e all’esterno si ha uno spessissimo strato di peptidoglicano. I gram - a seguito della colorazione di Gram assumono un colore rosso piuttosto lieve, mentre i gram + hanno questa colorazione violetta piuttosto intensa.

3

Quando andiamo a parlare degli antibiotici che inibiscono la formazione della parete batterica, andiamo ad identificare 3 passaggi della sintesi della parete batterica e del peptidoglicano:

1. Fase: sintesi dei precursori che avviene nel citoplasma.
2. Fase: trasporto dei precursori attraverso la membrana citoplasmatica, vediamo questi precursori a ridosso della membrana interna, all’interno di questa membrana ci sono dei trasportatori apposta che legano questi precursori e che li traslocano nella parte esterna della membrana.
3. Fase: inserimento di questi precursori nella parete cellulare verso cui sono stati traslocati.

Principali antibiotici che vanno ad alterare la sintesi del peptidoglicano:

• Nella zona del citosol, 1° tappa troviamo Fosfomicina e Cicloserina.
• Nella zona centrale, quindi nella 2° tappa dove avviene la traslocazione abbiamo la Bacitracina.
• Ultima fase: azione della Vancomicina e Cefalosporine.

1) Primo antibiotico che agisce sulla prima tappa della sintesi del peptidoglicano:

D-alanina importante perché permetterà i legami crociati tra le 2 unità disaccaridiche.

4

2° antibiotico Fosfomicina: deriva dall’acido fosfonico, una sostanza analoga ad un enzima che è il fosfoenolpiruvato (PEP), è caratterizzata da un basso peso molecolare e da una struttura molto semplice che differisce dalle attuali formulazioni farmacologiche disponibili.

Questo antibiotico è molto importante perché era stato scoperto nel 1969 ed era stato abbandonato nell’uso clinico finché ha riacquistato interesse come farmaco alternativo o come opzione valida per il trattamento di infezioni batteriche gravi del sistema urinario o in altri distretti come le meningiti.

Molecola molto piccola, ha una buona biodisponibilità, ha pochissimi o quasi nulli effetti avversi per il paziente.

Per quanto riguarda la sua azione: impedisce la sintesi dell’acido N-acetilmuramico, legandosi covalentemente al sito attivo dell’enzima UDP enol-piruvil transferasi ed inattivandolo irreversibilmente.

Attività battericida verso gram-negativi e gram-positivi e bassa tossicità.

Ottima opzione terapeutica sia per il trattamento delle infezioni da gram + e gram -.

Antibiotici attivi sulla seconda tappa della sintesi del peptidoglicano

Siamo sulla superficie interna della membrana plasmatica dove c’è l’N-acetilmuramilpeptide e ha dei trasportatori lipidici che trasportano la subunità completa all’esterno della membrana plasmatica.

La bacitracina: inibisce la defosforilazione del trasportatore lipidico legandosi al bactoprenolo-difosfato e bloccando la rigenerazione. È un polipeptide ciclico tossico per l’uso clinico umano. (No per via endovenosa). Viene usato per trattamenti topici (sotto forma di pomate).

Ultima fase: formazione finale del peptidoglicano

2) Ultima fase che è la formazione finale del peptidoglicano.

Antibiotici attivi sulla terza tappa della sintesi del peptidoglicano.

La terza tappa avviene nel contesto del peptidoglicano e nello spazio periplasmatico (gram -), dove l’unità basale, liberata dal legame del trasportatore lipidico, si unisce all’estremità in accrescimento di una catena di peptidoglicano (transpeptidazione).

In questa fase c’è l’azione dei glicopeptidi e dei beta-lattamici.

Glicopeptidi

• Effetto battericida.
• Hanno un’azione ad ampio spettro, con una predilizione per i gram +.
• Sono usati per il trattamento contro stafilococchi, streptococchi, enterococchi e contro il clostridium.
• Sono antibiotici piuttosto antichi, uso clinico a partire dagli anni ’50.
• Hanno difficoltà a penetrare nei gram -, hanno una resistenza intrinseca nei confronti dei glicopeptidi, non riescono a penetrare nella membrana dei gram -.

Chi ritroviamo nel gruppo dei glicopeptidi:

• Vancomicina.
• Teicoplanina.
• Dalbavancina.
• Telavancina.
• Oritavancina.

Qual è la loro azione? Quella di legarsi all’estremità D-alanina-D-alanina del pentapeptide legato al bactoprenolo ed impediscono l’azione della transpeptidasi sequestrandone il substrato; quindi, la fase finale del glicopeptide non avviene.

5

Impiego dei glicopeptidi:

• Nelle endocarditi infettive.
• Enterocoliti.
• Importante: nelle diarree associate al clostridium difficile.
• Severe infezioni della pelle.
• Utili contro lo stafilococco aureus MDR (multi-drug-resistance) tra cui MRSA → S. aureus resistente alla meticillina.
• Infezioni delle basse vie respiratorie e infezioni ossee.

Beta-lattamici

Beta-lattamici (agiscono sulla 3 fase del peptidoglicano).

Sono antibiotici largamente utilizzati.

Inibiscono la sintesi della parete cellulare bloccando l’azione della transpeptidasi.

All’interno di questa famiglia troviamo: penicilline, cefalosporine, carbapenemi, monobattami.

La loro azione è quella di andare ad interferire con la transpeptidazione, in particolare legandosi e inibendo l’attività delle PBP (penicillin-binding-proteins) presenti sulla membrana cellulare. Quindi legandosi a queste proteine, inibiscono le transpeptidazioni, per cui non si ha la formazione della struttura polisaccaridica.

Caratteristiche: anello beta-lattamico, questa è l’unità minima che racchiude la potenza e l’attività dell’antibiotico di tipi beta-lattamico. In tutti si ha l’anello beta-lattamico più altre molecole che vanno a cambiare lo spettro d’azione.

Cefalosporine: alternativa e ampliamento dell’attività delle penicilline, vengono classificate per 1, 2, 3, 4, 5 generazione. Migliorano e ampliano lo spettro d’azione degli antibiotici.

Da ricordare: prima generazione: cefalozolin, seconda: cefuroxime, terza: cefotaxime, ceftazidime (metodi di fenotipizzazione e metodi in cui vado a investigare i meccanismi di resistenza, ricordare questi 2 antibiotici). Quarta: cefepime.

Penicilline

1° della famiglia dei beta-lattamici: penicilline.

La prima studiata è la penicillina naturale di tipo G, F, V: caratterizzate da una bassa tossicità.

Resistenza alla penicillina data da: penicillinasi, enzimi resistenti, andavano ad inibire l’attività delle penicilline. Per cui è stato necessario creare in laboratorio delle penicilline che non subissero l’attività inibitrice di questi enzimi; quindi, sono state create le penicilline resistenti alle penicillinasi es. cloxacillina.

6

Penicilline a spettro esteso es. ampicillina, amoxicillina (da ricordare per quando faremo i metodi di fenotipizzazione e di indagine dei meccanismi di resistenza).

Cefalosporine.

Beta-lattamasi: enzimi che inibiscono i beta-lattamici (antibiotico-resistenza).

Carbapenemi

Carbapenemi (da sapere).

Sono stati una delle primissime opzioni terapeutiche che vengono utilizzate per le infezioni gravi e anche per le infezioni delle vie urinarie, sono stati molto buoni per contrastare i m.o. MDR (multi-drug-resistance), sono spesso usati in associazione anche con altri antibiotici perché sono antibiotici molto importanti per la clinica.

7

Antibiotici che agiscono sulla sintesi proteica

I due bersagli principali degli antibiotici che agiscono sulla sintesi proteica sono:

• Subunità grande 50S.
• Subunità piccola 30S.

Elongation: allungamento del polipeptide.

8

Principali antibiotici di questa famiglia:

1. Gli Aminoglicosidi sono l’unica classe di antibiotici che interferiscono con la sintesi proteica, ad avere un’azione battericida. Tutti gli altri antibiotici che vanno ad interferire con la sintesi proteica hanno un’azione batteriostatica.

9

2. Tetra = 4 anelli, il tRNA non può legarsi.

Tetracicline: hanno un’azione batteriostatica ad ampio spettro, attivi contro Mycoplasma, largamente utilizzati in ambito medico ed in alcuni paesi come integratori alimentari negli allevamenti animali. Resistenza alle tetracicline ed il loro utilizzo è sconsigliato.

3. Glicilcicline, rappresentante della classe troviamo la tigeciclina.

Polimicrobiche = infezioni date non solo da un m.o. ma 2/3 m.o, si parla di polimicrobiche quando si ha un’infezione data da più di 2 m.o.

Sepsi: infezione del sangue in cui si ha un quadro clinico particolare, una febbre molto alta, sistema immunitario debilitato.

10

4. Ricordare eritromicina.

5.

6. La sua azione lo vedo implicato contro i Gram +, in particolare contro lo stafilococco aureus ampicillina resistente e VRE = enterococchi resistenti alla vancomicina.

11

7. È uno dei pochi antibiotici che può dare degli effetti contro i ribosomi mitocondriali, quindi si può avere inibizione nella cellula eucariotica, soprattutto in quelle che sono in rapida crescita e che hanno quindi un’elevata attività mitocondriale.

Se utilizzo Cloramfenicolo, quali sono le cellule eucariotiche verso cui si avrà una problematica, in rapida crescita e con un’attività mitocondriale elevata?

• Le cellule staminali del midollo osseo, per cui l’utilizzo del cloramfenicolo in clinica deve essere assolutamente controllato e stare attenti al paziente che si ha.

Antibiotici attivi sulla replicazione del DNA

Antibiotici attivi sulla replicazione del DNA.

Parliamo di una reazione contro le topoisomerasi e le girasi. Capostipite di questi antibiotici: acido nalidixico, usato per le infezioni delle vie urinarie, soprattutto causate dagli enterobatteri (si intende E. coli, Klebsiella pneumoniae). In seguito sono stati creati dei nuovi farmaci di questa categoria più potenziati, che riescono ad agire anche contro P. aeruginosa, gram - che non fa parte degli enterobatteri, contro altri gram + e micobatteri.

12

Importante da ricordare in questa nuova classe di antibiotici: Ciprofloxacina.

Unico rappresentante che va a inibire la sintesi dell’RNA: Rifampicina.

La rifampicina ha un colore tipico rosso. Blocca la trascrizione da DNA a RNA. Grazie a questo blocco della trascrizione, può essere usata sia contro gram + che -.

Antibiotici che danneggiano le membrane batteriche

Antibiotici che danneggiano le membrane batteriche, due gruppi: Polimixine e daptomicina.

MRSA = stafilocco aureus meticillina resistente.

Antibiotici che agiscono bloccando il metabolismo dei folati

Antibiotici che agiscono bloccando il metabolismo dei folati, quindi dell’acido folico.

13

In qualche modo è come se andasse ad interferire con la sintesi delle proteine e del DNA.

Antibiotici che agiscono bloccando il metabolismo dei folati.

1.

2.

14

Discorso dell’antibiotico-resistenza

Discorso dell’antibiotico-resistenza.

Cosa bisogna fare quando siamo in presenza di un antibiotico-resistenza?

Specialità di introdurre in clinica, di approvare ogni anno un numero crescente di opzioni terapeutiche, quindi in questo caso magari di nuovi antibiotici. Nella slides vediamo quanti antibiotici sono stati approvati in tot. anni dalla FDA.

Antibiotici approvati negli ultimi 5 anni dalla FDA: sono per metà antibiotici associati a degli inibitori (i primi 3), altri sono nuovi antibiotici.

Ceftazidime/avibactam

Nuova combinazione antibiotica con un inibitore, che è stata approvata per l’uso clinico nel trattamento delle infezioni complicate intra-addominali e delle infezioni delle vie urinarie, incluse le pielonefriti.

Studi clinici hanno visto che l’utilizzo di questo antibiotico permette di mantenere un livello di sensibilità per almeno il 94 o 100% della popolazione batterica su cui viene testato. Non possono essere usate nei confronti di P. aeruginosa MDR.

15

ESBL = beta lattamasi a spettro esteso.

2.

3.

Antibiotico approvato negli ultimi 5 anni, ha dato un’ottima risposta alla terapia delle infezioni urinarie delle vie complicate ecc…

In vitro (quindi non ancora per uso clinico).

Laboratorio di microbiologia

Laboratorio di microbiologia, qual è il suo ruolo/azione?

1. Isolare il batterio che causa l’infezione.
2. Determinare la corretta identificazione a livello di specie.
3. Selezionare un’appropriata batteria di farmaci da saggiare, per vedere se il m.o. ha delle resistenze o meno.
4. Esprimere la sensibilità secondo criteri orientati alla terapia finale per il paziente.

16

Il fine è sempre quello di trovare una terapia per un paziente, che ha una sintomatologia.

Quando siamo in ospedale e arriva un paziente con una sintomatologia, cosa deve fare un primo operatore?

Paziente