Membrane biologiche e microscopia

Cellula eucariote

Eucariote viene da "eu" (buono) e "karyon" (nucleo), e significa con un nucleo ben definito. Quando parliamo di cellule eucariote, parliamo di cellule complesse, caratterizzate dalla presenza di vari organuli. Per riuscire ad avere immagini delle strutture cellulari si usa il microscopio elettronico (TEM) a trasmissione, quello a scansione serve per lo studio di proprietà prettamente topologiche.

Struttura della cellula eucariote

Una cellula eucariote è formata da:

• Nucleo: contiene la cromatina (suddivisa in eucromatina ed eterocromatina)
• Citoplasma: Detto impropriamente membrana nucleare. È in realtà Involucro nucleare una doppia membrana. Si ottiene dall'espansione di una cisterna del sistema endomembranoso. Tale cisterna è appiattita ed è a sua volta formata da una membrana e da uno spazio interno detto lume o cisterna perinucleare. La struttura dell'involucro è fatta in modo tale da "svanire" nucleoplasma durante il processo nucleare, in quelle fasi in cui è necessario che i cromosomi siano liberi di muoversi nel citoplasma.
• Nucleolo: Spazio non delimitato da membrana, molto ricco di cromatina ed altre molecole (DNA, RNA e proteine) coinvolte nella produzione di RNA ribosomiale.

Sia il sistema endomembranoso, sia il nucleo, sia le cellule eucariotiche è stato teorizzato derivino dalle cellule procariotiche ancestrali (batteri). Le cellule procariotiche ancestrali possedevano un sistema di ribosomi e di DNA (passaggio da RNA a proteine a DNA).

Un aumento del volume della cellula porta ad un allungamento della membrana cellulare, che tende ad invaginarsi su sé stessa formando degli spazi interni. Topologicamente parlando, questi spazi interni, sono uguali allo spazio esterno, con il quale la cellula scambia continuamente materiali tramite endocitosi (porta dentro materiali) ed esocitosi (porta fuori materiali). Tra i due processi va mantenuto un equilibrio costante (anche quelle cellule che esocitano in maniera nettamente superiore di quando endocitano regolano l'equilibrio tramite micro-invaginazioni spontanee).

Gli spazi interni che si formano nella cellula sono detti luminali, sono contenti varie proteine solubili (provenienti dal citoplasma). Le forme dei nuclei seguono le forme delle cellule: cellule piatte avranno nuclei appiattiti, cellule circolari nuclei circolari ecc.

Teorie sull'origine delle cellule eucariote

Secondo questa teoria, quindi, la cellula eucariote origina da un procariote ancestrale tramite formazione del nucleo per invaginazione della membrana plasmatica. Ma la cellula eucariote differisce dal procariote anche per la presenza dei mitocondri.

Per l'origine dei mitocondri (non presenti nei procarioti) è accettata l'ipotesi dell'endosimbiosi. Secondo questa teoria i mitocondri vengono considerati dei batteri ancestrali a loro volta veri e propri.

Dalla cellula procariote ancestrale dobbiamo immaginare l'essersi formata una cellula ancestrale aerobica tramite endocitosi della "struttura mitocondriale" (stesso processo di ingerimento dei batteri da parte dei macrofagi, senza digestione di questi ultimi), e una cellula eucariote anaerobica. Da qui la struttura mitocondriale si è ridotta, quella nucleare espansa. Il mitocondrio quindi si è ridotto a mantenere solo quei geni necessari per il suo stesso funzionamento. Esso è infatti dotato di un proprio materiale genetico, Dna mitocondriale, le cui mutazioni sono responsabili delle patologie mitocondriali.

Queste ultime sono a trasmissione materna; infatti, i mitocondri dello zigote sono provenienti dalle cellule materne. Quelli paterni, contenuti negli spermatozoi sono usurati dal movimento degli stessi verso l'oocita e quindi, se riescono ad entrare nella cellula uovo vengono immediatamente distrutti.

Cellule eucariote odierne: unione procarioti aerobici ed eucarioti anaerobici. Organismi eucarioti monocellulari: Protozoi. Si pensava che le cellule eucariotiche avessero citoscheletro, mentre i procarioti no. Invece questi ultimi hanno dei corrispettivi di actina e tubulina.

Incorporazione di batteri aerobi e batteri fotosintetici (Cianobatteri, contenenti organuli detti cloroplasti) dà vita alla cellula vegetale. La cellula è formata da una rete di membrane sotto forma di sacchi appiattiti detti cisterne che formano:

• REL (reticolo endoplasmatico liscio)
• RER (reticolo endoplasmatico rugoso)
• Apparato (o Complesso) di Golgi

Non sono dei compartimenti stagni, ma tra loro avviene un continuo scambio tramite le vescicole di trasporto. L'apparato di Golgi si trova in prossimità dell'involucro nucleare, si forma grazia alla vicinanza (concatenazione) di 3, 5 o 6 cisterne appiattite. Può temporaneamente essere assente nella struttura cellulare. È una sorta di officina di passaggio per le proteine che entrano ed escono dalla cellula. È formato da un versante cis (di ingresso) e un versante trans (di uscita).

Conclusioni

La cellula è un sistema altamente integrato di funzioni che si basa su un'organizzazione interna in grado di permettere:

• Alta efficienza dello svolgimento dei processi metabolici: compartimentalizzazione
• Scambio di informazioni tra i diversi compartimenti: nucleo-citoplasma-sistemi membranosi-organuli

Microscopio ottico

Esistono due tipi di microscopio: ottico ed elettronico. È importante studiare questi apparecchi per capire le caratteristiche delle immagini che essi producono e che sono la base degli studi biologici.

La storia del microscopio parte molto tempo fa. Nel 1590 Haus e Zacarias Janssen, due costruttori di lenti olandesi, costruirono il primo microscopio, che consisteva in un apparecchio formato da due lenti in grado di ingrandire gli oggetti osservati tramite esse. Nel 1665, Robert Hooke, che al tempo lavorava per la Royal Society di Londra, usò questo dispositivo per ingrandire e studiare quelle che chiamò "cellule" (strutture compositive della materia osservata, che avevano una forma di cella, piccola rientranza). Fondamentale fu per questo scopo l'illuminazione del composto studiato dal basso, grazie a una candela, che permise appunto di osservare le "cellule" mediante fenomeni di diffrazione luminosa.

Nel 1683 il naturalista Anthoine van Leevwenhoek costruì un microscopio con un'unica lente, ma più potente del precedente e riuscì ad osservare per la prima volta l'interno di cellule vive (spermatozoi, protozoi, batteri, globuli rossi). Notò quindi la complessa varietà degli organuli cellulari.

Il microscopio ottico si basa sull'utilizzo di una fonte di luce visibile. Le lenti sono presenti sia sotto che sopra il preparato campione. Quella inferiore, che si trova nel condensatore, serve a concentrare, a riflettere, la luce proveniente dalla sorgente. La posizione è regolabile tramite manopole, consentendo di osservare interamente il vetrino. Il punto di condensazione della luce è in corrispondenza dell'obiettivo (che può essere regolato ad altezze diverse tramite il REVOLVER). Un ingrandimento aggiuntivo è dato dall'inserimento di una lente intermedia. Una lente ulteriore si trova nell'oculare, alla fine del microscopio. Le immagini prodotte vengono fissate da una macchina fotografica e salvate in un computer. Queste si chiamano micrografie.

Microscopio ottico vs microscopio elettronico

Ambedue utilizzano una sorgente di energia di natura elettromagnetica e un sistema di lenti. Nell'elettronico l'immagine si forma alla base di una colonna, all'interno della quale c'è il vuoto, in cui vengono pompati (da una pompa apposita) elettroni generati, o meglio rilasciati, da un filamento di tungsteno riscaldato.

Gli elettroni vengono allineati e quindi direzionati dalle lenti elettroniche, che sono in realtà dei magneti. I magneti sono gli equivalenti delle lenti del microscopio ottico. Il flusso elettronico va quindi dritto ad incontrare il campione, che viene, quindi, attraversato dal fascio elettronico. Gli elettroni, seppur direzionati, non attraversano materiali molto spessi. Con i materiali giusti, questi ultimi vengono impressionati sul fondo, su una lastra posizionata alla fine della colonna vuota.

Nella sezione sono introdotti dei coloranti elettronici, diversi da quelli che si usano in campo chiaro. Sono usati per studiare le affinità delle sostanze esaminate e catalogarle. Nel microscopio ottico si usa analogamente un fascio di fotoni, cioè di particelle luminose. Mentre i microscopi ottici permettono di osservare il risultato direttamente ad occhio nudo, nel microscopio elettronico si necessita di una lastra su cui viene impressionata l'immagine.

Caratteristiche fisiche del raggio di luce: lunghezza d'onda, v= velocità di propagazione, f= frequenza. Oggetti che interferiscono con quest'onda hanno dimensioni "elevate". Man mano che gli oggetti sono più piccoli, l'interazione con l'onda luminosa è più difficile. Per aumentare la possibilità di interferenza va aumentata la velocità di propagazione. Nel fascio elettronico la frequenza maggiore consente di osservare oggetti di dimensioni più piccole. I microscopi hanno quindi dei limiti di risoluzione.

Come si comporta un materiale biologico attraversato da un'onda luminosa? Le onde luminose, quando attraversano la cellula non colorata, possono subire vari gradi di ritardo. Proprio questo rallentamento dipende dalla densità diversa dei diversi materiali analizzati. Il rallentamento delle onde che attraversano il materiale è dovuto all'indice di rifrazione. L'occhio umano non percepisce queste variazioni, ma il microscopio sì, riproducendo l'interferenza tra le onde rifratte e non rifratte, aumentando il contrasto tra le varie superfici, rendendole visibili all'occhio nudo, tramite l'inserimento di un contrasto.

Esame istologico al microscopio

L'esame istologico di un campione al microscopio è condizionato da:

• Contrasto
• Ingrandimento (per il microscopio ottico = 100X)
• Potere di risoluzione

Potere di risoluzione: esiste un limite oltre cui l'immagine appare sfocata nei contorni. Il potere di risoluzione è definito come la distanza minima a cui due oggetti si devono trovare per apparire nitidamente separati se osservati tramite microscopio. Dipende da tre parametri:

• Lunghezza d'onda della luce
• Indice di rifrazione del mezzo in cui si trova il campione (aria nell'ottico e vuoto nell'elettronico solitamente)
• Apertura angolare della lente. Si definisce come l'emi angolo formato da metà della larghezza angolare del cono di raggi raccolti dall'obbiettivo (metà del cono di luce formato con il suo asse orizzontale). Le lenti migliori sono quelle ad alta apertura angolare poiché catturano e rilasciano maggiore luce. Sperimentalmente si verifica che l'apertura angolare ottimale è ≤ 70°.

Per valutare contemporaneamente l'influenza di questi tre parametri esiste un'equazione che li racchiude: l'equazione di Abbe. Il risultato dell'equazione di Abbe è un parametro definito come limite di risoluzione (r). 0,61 ≤ sin ≤ ≤ 70°), dove r è il potere di risoluzione, λ è la lunghezza d'onda del fascio luminoso (400 ≤ λ ≤ 700), α è l'apertura angolare della lente e n è l'indice di rifrazione del mezzo (1 per l'aria, 1.5 per l'olio). L'olio è usato frequentemente in microscopia ottica per aumentare il potere di risoluzione.

Il concetto di limite di risoluzione è applicabile al microscopio elettronico considerando che la lunghezza d'onda dell'elettrone è 100000 volte più piccola di quella della luce visibile. Il fattore sin(α) viene solitamente indicato con il prodotto NA, definito apertura numerica.

Calcolo del limite di risoluzione

EX: Calcolare il limite di risoluzione. 0.61 × 530 = 3441 × 0.94. Due punti a distanza minore di 344nm non saranno visibili come separati nitidamente. Migliorare la risoluzione è possibile in due modi diversi:

• Abbassando la lunghezza d'onda della luce usata (esempio luce blu)
• Aumentando l'indice di rifrazione del mezzo utilizzato (esempio olio)

Allestimento di un preparato per la microscopia ottica

Preparare un materiale biologico per l'esame in microscopia ottica è un processo in varie fasi che si svolge nel seguente modo:

• Dissezione del materiale biologico
• Fissazione
• Disidratazione
• Inclusione
• Sezionamento
• Reidratazione
• Colorazione

La dissezione avviene in tutti i microscopi tranne che in quello a contrasto di fase. Gli altri step sono validi per tutti i tipi di microscopio. Qualsiasi sia il materiale preso in esame è necessaria la fissazione, che avviene ad opera di sostanze in grado di evidenziare le caratteristiche del materiale preso in esame quando è posto in soluzione acquosa. In quanto tende a prevenire la decomposizione e mantiene inalterato il quadro strutturale dei tessuti. In seguito al prelievo, le componenti tissutali che sono state asportate, perdono le loro iniziali proprietà chimiche e fisiche, ciò a causa dei microorganismi che attaccano il materiale biologico e della variazione di temperatura e di pH. Attraverso la fissazione, si cerca di fissare le molecole di un tessuto allo stato chimico e nella posizione in cui si trovavano in vivo, inoltre, per evitare l'autolisi, si agisce sulle componenti proteiche inattivando degli enzimi.

I fissativi utilizzati si distinguono in fissativi fisici e fissativi chimici. La fissazione fisica può avvenire per rapido riscaldamento, in cui il campione viene essiccato eliminando l'acqua e denaturando la componente proteica, oppure tramite congelamento. Il congelamento prevede due metodi: il metodo del congelamento-essiccamento e congelamento-sostituzione. I fissativi chimici sono suddivisi in: fissativi coagulanti le proteine, come acido acetico o alcool etilico; fissativi non coagulanti le proteine, come la formalina e il tetrossido di osmio.

Si possono classificare inoltre tre tipi secondo la loro natura chimica:

• Aldeidi (formaldeide, che forma ponti metilenici, e formalina)
• Alcoli (alcool etilico e metilico)
• Acidi (acido acetico e picrico)

Gli ultimi due effettuano una fissazione rapida, le prime una fissazione lenta. Il processo consiste quindi in un bloccaggio dei meccanismi biologici ad un istante. La disidratazione è uno step necessario se non avviene spontaneamente della fissazione (come quando si usano direttamente alcoli), che avviene tramite soluzioni di etanolo sempre più concentrate usate come solventi per il materiale biologico da cui si fa fuoriuscire l'acqua.

L'inclusione non è un passaggio molto semplice. I tessuti biologici prelevati hanno perso la loro consistenza, quindi devono essere inclusi all'interno di materiali più resistenti, in modo tale da acquisire una maggiore rigidità, ideale per il successivo sezionamento. L'inclusione non è necessaria se è avvenuta la fissazione fisica.

Si tratta in sostanza di far entrare all'interno del materiale biologico delle sostanze più o meno dense che fungono da sostitutivo per l'acqua. Esistono tre tipi di inclusivi:

• Cere: paraffina (usata principalmente per la microscopia ottica)
• Gelatine e celloidina
• Resine plastiche: resina epossidica

Le ultime due classi, se illuminate polimerizzano, diventando più dure della paraffina. In particolare, le resine vengono usate per sezioni sempre più sottili. Possiamo quindi dire che più sottile deve essere la sezione più duro deve essere il materiale di inclusione.

Il sezionamento è la fase successiva. Il blocchetto di paraffina ottenuto deve essere sezionato ricavando fette estremamente sottili, circa 5-7 (può arrivare fino a 12) μm, in modo tale che la luce possa attraversarle e, dopo la colorazione, siano ben visibili al microscopio. Quando usiamo resine in microscopia ottica possiamo arrivare fino a sezioni di 1-2 μm.

Questo processo di taglio avviene su un supporto di plastica, tramite un apparecchio che si chiama microtomo. È un lavoro finemente regolato poiché richiede estrema precisione nel taglio. Quando per la fissazione usiamo il congelamento, si passa al sezionamento in maniera diretta. In questo caso il microtomo viene detto criostato, poiché viene inserito in un freezer che mantiene il nostro materiale congelato.

Tagliando una biopsia si ottengono le sezioni seriali. Queste sono studiate tutte integralmente per avere una visione completa del materiale analizzato. (sezione longitudinale, tangenziale, trasversale ed obliqua) Si utilizzano vari piani di taglio.

La colorazione è la fase finale del processo di preparazione. Essa è sempre preceduta da reidratazione qualora sia avvenuta disidratazione. Prima si eliminano le sostanze usate come inclusori con appositi solventi e poi si reintroduce l'acqua negli spazi da essi occupati.

Il processo di colorazione si basa sul fatto che tutte le sostanze biologiche hanno una carica; quindi, anche i coloranti che possono essere:

• Basici: famiglia dei blu
• Acidi: famiglia dei rossi

I due tipi vengono di solito mescolati e le micrografie ottiche risultano colorate con sfumature di viola. I coloranti acidi (ricordiamo l'Eosina) si legano a molecole con caratteristiche basiche, come le proteine citoplasmatiche, mentre i coloranti basici (ricordiamo l'Emallume acido di Mayer) si legano a molecole con caratteristiche acide, come il DNA. In genere questi coloranti vengono combinati tra loro per far risaltare al meglio le diverse componenti cellulari e tissutali.