Laboratorio di analisi microbiologica degli alimenti

Laboratorio microbiologia degli alimenti

10 : 90 = 11: x → 90 perché 10 alla -1. 90 x 11 : 10.

Tecniche di asetticità

Le tecniche di asetticità servono a ottenere e mantenere pure le colture di microrganismi e svolgere il lab di micro in sicurezza.

Regole:

• Usare terreni e attrezzature sterili.
• Lavorare vicino alla fiamma del Bunsen.
• Sollevare i coperchi delle piastre Petri solo parzialmente.
• Tenere i tappi delle provette tra le dita e non appoggiati sul bancone.
• Flambare il collo della superficie esterna della provetta prima e dopo il prelievo.
• Arroventare le anse e gli aghi da inoculo alla fiamma per l’intera lunghezza dell’astina metallica.
• La fiamma del Bunsen deve essere ossidante blu e alta 5 cm.
• Quando il Bunsen non si usa si deve lasciare la fiamma gialla.
• Sterilizzare la vetreria.
• Disinfettare il bancone.

Tecniche di sterilizzazione

Calore secco

A. Aria calda → si usa la stufa e si usa per sterilizzare la vetreria. 160 gradi x 60 minuti.

B. Flambatura → superficie esterna delle provette.

C. Arroventamento → si usa il becco Bunsen.

Calore umido

A. Tindallizzazione → si usa per i terreni nei quali possono crescere spore. Viene esposta a vapore fluente ad una T di 100 gradi con un trattamento ripetuto per 3 giorni così se le spore non muoiono al primo trattamento di calore muoiono a quello dopo.

B. Vapore sotto pressione → si usa l’autoclave che unisce l’azione del calore alla pressione. Il potere di penetrazione del vapore acqueo nel substrato viene aumentato dovuto alla pressione. 121 gradi x 15 minuti ad 1 atm.

Filtrazione

A. Filtri millipore → si usa per le sostanze che non possono essere sterilizzate a caldo. Si usano filtri porosi di acetato di cellulosa, capaci di trattenere i batteri di grandezza superiore ai loro pori.

B. Membrane filtranti → per filtrare campioni liquidi al fine di trattenere i batteri in esso presenti. Sono sterilizzate a caldo.

Autoclave

L’autoclave assicura la distruzione delle endospore batteriche. Si usa per la sterilizzazione di utensili, camici, vetreria e la maggior parte dei terreni liquidi e solidificabili. È importante perché assicura la totale distruzione dei micro. Viene immesso vapore saturo. La pressione è di una atm e raggiunge 121 gradi. Le norme per l’utilizzo di un’autoclave → bisogna fare attenzione all’acqua. I materiali non devono essere mai sigillati o avvitati perché l’aria che c’è all’interno del nostro materiale può uscire.

Criteri microbiologici

I criteri microbiologici servono per determinare la presenza o numero di micro indicatori o patogeni che possono essere utilizzati per giudicare l’alimento. Un criterio stabilisce quindi le micotossine presenti nell’alimento. Deve fornire le caratteristiche dell’alimento, i metodi analitici che devono essere utilizzati, quale piano di campionamento deve essere utilizzato e quali sono i limiti microbiologi.

I criteri microbiologici li possiamo dividere in due categorie:

• Obbligatori → non devono essere superati, alimento che li supera deve essere tolto dal commercio.
• Consigliati → consentono di esprimere un giudizio di accettabilità.

Il numero e la grandezza del campione devono essere stabiliti statisticamente mediante casualizzazione ovvero bisogna trovare delle parti di campione che devono essere rappresentative del campione che stiamo analizzando.

Bisogna tenere conto della distribuzione e della stratificazione microbica e dell’influenza dell’errore analitico. Il campione deve essere rappresentativo del lotto.

Criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari

Regolamento (CE) n. 2073/2005.

“Campione’’: una serie composta di una o più unità o una porzione di materia selezionate tramite metodi diversi in una popolazione o in una quantità significativa di materia e destinate a fornire informazioni su una determinata caratteristica della popolazione o della materia oggetto di studio e a costituire la base su cui fondare una decisione relativa alla popolazione o alla materia in questione o al processo che le ha prodotte.”

“Campione rappresentativo: un campione nel quale sono mantenute le caratteristiche della partita dalla quale è prelevato, in particolare nel caso di un campionamento casuale semplice, dove ciascun componente o aliquota della partita ha la stessa probabilità di figurare nel campione.”

L’analisi microbiologica degli alimenti

1 fase: campionamento.

Prelievo di una quantità di campione rappresentativa di un lotto di prodotto.

Lotto: quantità di prodotto alimentare ottenuto, trattato e conservato in condizioni uniformi in un ciclo di produzione omogenea, comunque identificabile.

Numero e grandezza del campione devono:

• Essere stabiliti statisticamente mediante “casualizzazione” → bisogna prelevare delle porzioni di campione che siano il più possibile rappresentative del lotto originario che stiamo analizzando.
• Tener conto della distribuzione e della stratificazione microbica e dell’influenza dell’errore analitico.

Criteri microbiologici e piani di campionamento

Per giudicare la qualità e la sicurezza microbiologica di un alimento si valuta la presenza o il numero di microrganismi indicatori o patogeni, ma per dare un giudizio obiettivo ci si deve riferire a dei criteri microbiologici precisi, per cui le analisi microbiologiche degli alimenti mirano fondamentalmente ad accertare che l’alimento rispetti specificati criteri microbiologici.

Un “criterio microbiologico” stabilisce i limiti della presenza o assenza di specifici microrganismi o loro tossine negli alimenti.

Un criterio microbiologico deve fornire le seguenti informazioni:

• Le caratteristiche per identificare l’alimento.
• Il tipo, la specie o il gruppo di organismi da ricercare.
• I metodi analitici da usare.
• Il piano di campionamento.
• I limiti microbiologici applicabili per lo specifico prodotto.
• Il punto della catena di produzione/trasformazione al quale si applica le azioni da intraprendere quando i limiti non sono rispettati.

«Criterio microbiologico», un criterio che definisce l’accettabilità di un prodotto, di una partita di prodotti alimentari o di un processo. Come si definisce l’accettabilità? → in base all’assenza, alla presenza o al numero di microrganismi e/o in base alla quantità delle relative tossine/metaboliti, per unità di massa, volume, area o partita;

«Criterio di sicurezza alimentare», un criterio che definisce l’accettabilità di un prodotto o di una partita di prodotti alimentari, applicabile ai prodotti immessi sul mercato;

«Criterio di igiene del processo», un criterio che definisce il funzionamento accettabile del processo di produzione. Questo criterio, che non si applica ai prodotti immessi sul mercato, fissa un valore indicativo di contaminazione al di sopra del quale sono necessarie misure correttive volte a mantenere l’igiene del processo di produzione in ottemperanza alla legislazione in materia di prodotti alimentari. Bisogna vedere se i livelli di igiene del vario processo produttivo vadano bene e che siano sotto i limiti di legge. Si individuano i punti critici per andarli poi a migliorare.

Microrganismi/tossine da monitorare ai fini della sicurezza alimentare

• Listeria monocytogenes.
• Salmonella spp.
• Enterotossine stafilococciche → micotossina.
• Enterobacter sakazakii.
• E.coli.
• Istamina → micotossina.

Microrganismi/tossine da monitorare ai fini dell’igiene di processo

• Conteggio microbico totale aerobico.
• Salmonella spp.
• Enterobacteriacee.
• E.coli.
• Stafilococchi coagulasi positivi.

Ci sono 2 tipi di piano di campionamento: a 2 classi o a 3 classi.

Piani di campionamento a due classi

1. Piani di campionamento a due classi.

Il campione può ricadere in una di due classi: accettato o rifiutato. Dunque questi piani vengono usati per decisioni presenza/assenza.

n: numero di unità da campionare e da sottoporre ad analisi; per unità campionaria (u.c.) deve intendersi una porzione singola o confezione di prodotto alimentare scelta a caso su cui si eseguiranno le analisi; devono essere rappresentative del lotto stesso.

m: numero limite di batteri che determina l’inaccettabilità del lotto;

c: numero massimo di unità campionarie che possono superare il valore di m accettate per esprimere l’idoneità del lotto.

Di seguito è riportato un esempio per illustrare come si interpretano i risultati di un piano a 2 classi.

Es1. n=5 c=2 m=0 → il lotto verrà scartato se trovo 3 campioni maggiori di 0.

Il lotto è fuori dai criteri se più di 2 u.c. presentano il microrganismo.

Es2. n=5 c=0 m=0 → verrà scartato perché qua dice che nessuna unità campionaria può avere micro.

Piani di campionamento a tre classi

2. Piani di campionamento a tre classi.

Il campione può ricadere nelle seguenti tre classi:

• Da 0 a m.
• Da m a M.
• Al di sopra di M.

Le tre classi qualitative per le n unità campionarie sono identificabili con le seguenti lettere:

m: valore limite del numero di batteri; il risultato è considerato soddisfacente se il numero di batteri in tutte le unità campionarie analizzate è inferiore ad m;

M: valore massimo del numero di batteri tollerato; il risultato è considerato insoddisfacente se il numero di batteri in una o più delle unità campionarie analizzate è superiore ad M;

c: numero delle unità campionarie il cui valore può essere compreso tra m ed M; il campione viene considerato ancora accettabile se il numero di batteri delle altre unità campionarie è pari o inferiore ad m.

Il piano di campionamento a tre classi consente una maggiore flessibilità nell’interpretazione di risultati positivi, ammettendo la possibilità che una piccola proporzione dei campioni analizzati (c) possa superare, entro un certo limite, il valore massimo consentito (m).

Diluenti usati in microbiologia

I campioni alimentari solidi prima di essere analizzati, vanno omogeneizzati in un adatto diluente, (non si può fare un campionamento senza aver diluito il prodotto e omogeneizzato) al fine di disperdere i microrganismi nella fase liquida che può essere facilmente manipolata per l’analisi. La scelta del diluente è una fase molto importante dell’analisi, in quanto diluenti non adatti, come ad esempio l’acqua, possono causare danneggiamenti delle cellule microbiche, con conseguente sottostima del numero di microrganismi.

Le principali caratteristiche dei diluenti sono:

1. Isotonicità (stessa pressione osmotica delle cellule microbiche);
2. Assenza di componenti nutritivi (o presenti in minima quantità);
3. Bassa tensione superficiale (favorisce la miscelazione del liquido con il substrato agarizzato fluido).

Diluenti usati in microbiologia:

• Soluzione peptone-sale.
• Soluzione fisiologica.
• Soluzione di Ringer diluita 1:4.
• Soluzione di citrato trisodico → si usa per i formaggi.

Il diluente si sceglie in base all’alimento che si vuole utilizzare.

Una volta scelta il diluente si scelgono i terreni nutritivi.

Terreni nutritivi per la coltivazione dei microrganismi

Un terreno di coltura può essere definito come l’ambiente nutritivo artificiale creato in laboratorio per far crescere un microrganismo.

In base alla composizione in nutrienti si possono dividere in due gruppi:

1. Terreni a composizione chimica definita: se ne conosce l’esatta composizione percentuale delle sostanze chimiche (organiche e inorganiche) utilizzate per la loro formulazione;
2. Terreni complessi o a composizione indefinita: nella loro formulazione contengono sostanze di origine varia e, nella maggior parte dei casi, di derivazione naturale (animale e vegetale) di cui non è nota la precisa composizione dei nutrienti.

Terreni nutritivi per la coltivazione dei microrganismi:

1. Terreni nutritivi liquidi: detti anche brodi, sono preparati sciogliendo in acqua tutti i componenti necessari.
2. Terreni nutritivi solidi: sono resi tali aggiungendo, alla soluzione dei nutrienti, una sostanza gelificante come l’agar, che è un mucopolisaccaride sulfonato estratto da alghe rosse che, una volta fluidificato a temperature superiori a 85°C, solidifica quando viene lasciato raffreddare a temperature inferiori a 45°C. In genere è usato a concentrazioni dell’1,5% per preparare terreni solidi e allo 0,75% per terreni semi-solidi (agar soft).

Terreni nutritivi per la coltivazione dei microrganismi:

1. Terreni per uso generale: presentano una composizione in nutrienti tale da soddisfare la crescita della maggior parte dei microrganismi di uno specifico gruppo (batteri, lieviti e muffe). Si usano per determinare la carica microbica totale.
2. Terreni selettivi: oltre ai normali componenti nutritivi, contengono sostanze chimiche che esercitano un’azione inibente nei confronti di alcuni microrganismi o gruppi di microrganismi, senza interferire, nelle dosi di utilizzo, con l’organismo da isolare. Ad esempio se la sostanza chimica è un antibiotico all’interno non cresceranno batteri.
3. Terreni selettivi e differenziali: sono terreni selettivi ai quali sono aggiunte particolari sostanze chimiche che determinano una modificazione del terreno come conseguenza di una particolare attività metabolica del microrganismo da isolare, differenziandolo dalle specie che non sono in grado di utilizzare il composto differenziale (ad esempio la capacità del microrganismo di fermentare un particolare carboidrato o di produrre particolari metaboliti che rendono “caratteristica” la colonia microbica da isolare). Mi permette di distinguere i vari micro.

Fasi per la preparazione di un terreno di coltura

1. Pesare esattamente i componenti secondo la ricetta.
2. Aggiungere acqua distillata nella misura richiesta.
3. Sciogliere gli ingredienti riscaldando fino a 40-50°C per i terreni liquidi e fino all’ebollizione per i terreni contenenti agar.
4. Dispensare il terreno in bottiglie o in provette muniti di tappo.
5. Sterilizzare in autoclave a 121°C (1 atm) per 15 minuti, in modo da eliminare tutti i microrganismi, sporigeni e non, contaminanti. Alcuni terreni vanno solo riscaldati fino ad ebollizione oppure sterilizzarli per filtrazione.
6. Aggiungere al terreno sterile e raffreddato a 45-47°C eventuali supplementi selettivi sterili.

Dopo sterilizzazione i terreni agarizzati possono essere dispensati in piastre di Petri oppure in tubi per batteriologia lasciandoli solidificare in posizione verticale oppure inclinata (agar a becco di clarino o agar slant).

Metodi analitici per la numerazione dei microrganismi negli alimenti

Diversi sono i metodi utilizzati per la numerazione dei microrganismi presenti in un campione alimentare. Quelli maggiormente utilizzati sono:

Conteggio diretto microscopico, per cellule vitali e non;

1. Metodo del numero più probabile di microrganismi (Most Probable Number, MPN) per la determinazione statistica delle cellule vitali;
2. Tecniche che sfruttano la riduzione di coloranti per stimare il numero di microrganismi che possiedono capacità riduttive.
3. Conteggio standard di cellule vitali su piastra (Standard Plate Counts, SPC);

Metodi di conta diretti: le camere di conta

Conta diretta con microscopio delle cellule contenute in un volume noto di campione, attraverso l’impiego di camere di conta (camera di Thoma o di Burker o Neubauer a seconda del numero di celle che ci sono all’interno). La camera di conta è un vetrino settato dove si mette il micro.

Vantaggi.

• È un metodo rapido e poco costoso.

Svantaggi.

• È un metodo poco sensibile (già con 1x10^6 cellule/ml solo poche cellule sono visibili in ogni campo).
• Non è possibile distinguere cellule vive da cellule morte.
• L’affaticamento degli operatori può causare errori.
• È difficile da automatizzare → non ci sono dei software ma si fa tutto manualmente.
• È praticamente impossibile contare selettivamente determinati gruppi di microrganismi.

Metodi di conta diretti alternativi

FISH (Fluorescent In-Situ Hybridization). → fluorescenza in situ usando coloranti fluorescenti legati a sonde oligonucleotidiche è possibile eseguire conte selettive ed è possibile contare anche microrganismi non coltivabili.

Preparazione delle diluizioni decimali seriali

Il numero di microrganismi presenti in un dato campione alimentare, in genere, è così alto da non poter essere contato se non dopo essere stato sottoposto a diluizioni seriali. Consideriamo i seguenti esempi.

• Esempio 1: se noi seminiamo su un adatto terreno nutritivo 1 ml di latte e troviamo, dopo incubazione delle piastre, che si sono sviluppate 15 colonie, siamo in grado di concludere che il campione di latte conteneva 15 UFC/ml. Più realisticamente, la concentrazione di microrganismi in un campione di latte è considerevolmente più elevata, per cui il conteggio delle colonie su una piastra inoculata con 1 ml del campione potrebbe risultare impossibile.

Se io mettessi 1 ml latte la prima foto sarebbe il risultato. È una capsula Petri ricoperta di carica microbica. Facendo una diluizione il numero di colonie si espande come in foto e si riescono a contare meglio.

Unità formanti colonie → unità di cellule che quando si aggregano tra loro f