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ISTOLOGIA

MICROSCOPIA E CENNI SULL'ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO

L'insieme delle cellule forma un tessuto. I tessuti a loro volta formano organi, come fegato, pancreas, esofago etc. che

sono composti da più tessuti; negli organi in generale non sono presenti sempre tutti i tessuti, e non tutti i tessuti hanno

gli stessi rapporti, ma comunque un organo è composto da vari tessuti.

Gli organi vanno a comporre un apparato o un sistema, e l'insieme dei vari organi forma l'organismo.

Le cellule possono avere forme completamente diverse, la morfologia cambia a seconda della funzione, così come le

grandezze.

Le unità di misure che useremo in istologia, saranno il micron, cioè la millesima parte del millimetro (unità di misura

della microscopia ottica, che è di base per l'istologia), il nanometro, cioè la millesima parte del micron, e l'Amstrong

ovvero la decima parte del nanometro (unità di misura della microscopia elettronica, usata per osservare i componenti

cellulari). Microscopia

Sappiamo che l'uomo vede con gli occhi attraverso lo spettro della luce visibile con una lunghezza d'onda dai 180 ai

750 nm. Questa luce visibile è più "lunga" rispetto ai raggi UV che sono più corti, così come i raggi X gamma. A noi

interessa sapere cos'è il potere di risoluzione. È di base importante perché serve per capire i microscopi, che obiettivi

dobbiamo usare e cosa dobbiamo vedere; è la distanza minima alla quale due oggetti possono essere distinti: se prendo

due oggetti e li metto a una certa distanza, posso vederli ancora separati, più mi avvicino, più arrivo ad un punto in cui

vedo un'unica struttura. Per l'occhio umano, il potere di risoluzione è intorno ai 70 micron. Il microscopio permette di

aumentare il potere di risoluzione.

Il microscopio ottico. È detto anche microscopio luce, usa la luce dello spettro visibile per mettere in evidenza il

vetrino istologico. Si usano microscopi binoculari, i monoculari sono un po' in disuso. Struttura: possiamo vedere in

basso la base con la sorgente luminosa, e una manopola che, se giriamo fa in modo appunto, che arrivi la luce. Sapere

quanta luce arriva al preparato è importante: se è troppa non si vedrà, diventerà bianco e non riusciremo a contrastare.

Sopra la base appoggiamo il vetrino, e posteriormente vediamo due manopole con le quali possiamo spostare la base a

sinistra e a destra, o avanti e indietro; sopra abbiamo gli obiettivi, di solito 3 o 4, e gli oculari. Gli obiettivi si spostano in

un revolver, una struttura che gira, in modo tale da poter mettere l'obiettivo opportuno sul vetrino, gli oculari invece

hanno le lenti fisse. L'oculare di solito è 10x fisso, cioè, ingrandisce 10 volte la visione e a seconda degli obiettivi che si

utilizzano, possiamo ingrandire ancora di più: ad esempio 40x dell'obiettivo + i 10x dell'oculare, significa ingrandire 400

volte. L'obiettivo più piccolo permette una visione generale, e il 10x e 40x sono i classici per l'istologia. Posteriormente

a destra e sinistra, troviamo due manopole chiamate macrometrica e micrometrica: girando la manopola

macrometrica, mettiamo a fuoco, mentre la micrometrica permette una messa a fuoco più particolare.

Microscopio a fluorescenza. È un particolare tipo di microscopio ottico, cioè si basa sugli stessi ingrandimenti; la

differenza è che il microscopio a fluorescenza rileva delle sostanze fluorescenti naturali (fluorescenza primaria, cioè le

sostanze sono autofluorescenti), oppure fluorocromi che funzionano da markers (fluorescenza secondaria). Nel

microscopio a fluorescenza si illuminano sostanze e strutture con coloranti fluorescenti, legati da noi.

Vogliamo andare a vedere una proteina, o qualcosa della membrana etc.

Andiamo a vedere il fluorocromo, che si lega alla sostanza che vogliamo vedere, e indirettamente vediamo quello che

ci interessa. I fluorocromi normalmente non sono visibili a occhio nudo, ma devono essere colpiti da una luce più corta

dello spettro visibile come i raggi UV.

Questo tipo di microscopio non ha di base la luce dello spettro visibile ma una lampada, chiamata lampada a vapori di

mercurio, che emette raggi UV che colpiscono i fluorocromi, i quali vengono eccitati da questi raggi e emanano una

luce a una lunghezza d'onda più lunga, cioè, compreso nello spettro visibile; a seconda di quanto è lunga emaneranno

un colore particolare. Abbiamo sostanze fluorescenti naturali come vitamine, porfirine e clorofille, mentre per la

fluorescenza indotta usiamo markers fluorescenti, i più conosciuti sono fluorescina e rodamina: la prima emana una

luce che diventa verde l'altra rossa.

Inoltre, mentre per un preparato classico il vetrino può essere conservato per un tempo molto lungo, questo non è

possibile nei preparati per microscopia a fluorescenza, perché la fluorescenza decade e nel giro di pochi minuti non si

vedrà più nulla; con qualche accorgimento possiamo farla durare un po' di più; infatti, ci sono fotocamere incorporate

che permettono di fotografare il reperto.

Microscopio elettronico. Con il microscopio elettronico, andiamo ad aumentare il potere di risoluzione e possiamo

osservare strutture impossibili da vedere con il microscopio ottico. Non parliamo più in termini di micron ma di

Angstrom: possiamo vedere le strutture interne nella cellula, e aumentando la risoluzione anche proteine acidi nucleici

etc.; la differenza sostanziale tra i due tipi di microscopi è che l'ottico usa la luce dello spettro visibile, e nella

fluorescenza i raggi UV, in questo caso usiamo il fascio di elettroni che attraversa il preparato istologico. Inoltre, la

preparazione per la microscopia elettronica è molto differente, non parliamo di vetrino istologico ma di retino. Di base

ci sono due tipi di microscopi elettronici, TEM a trasmissione e SEM a scansione. Il TEM ha una buona visione,

migliore del SEM ma bidimensionale, il SEM da una visione tridimensionale anche se meno definita, di solito si usano

entrambi.

ALLESTIMENTO DI UN PREPARATO ISTOLOGICO

Allestire un preparato istologico, significa andare a vedere un tessuto per capire come è fatto morfologicamente e

fisiologicamente. Per l'analisi morfologica ci sono due metodiche: a fresco oppure tramite l'uso del vetrino istologico.

- METODICA A FRESCO: in teoria è migliore, ma è usata raramente soprattutto nell'istologia di routine. È

un'osservazione diretta di tessuti senza che abbiano subito trattamenti, se non in alcuni casi solamente

elaborati con coloranti vitali. Abbiamo limitazioni: scarso contrasto, cioè, riusciamo a differenziare poco il

tessuto, visto che, se non lo coloriamo è trasparente, e dato che non subiscono trattamenti, i tessuti vanno

incontro a fenomeni di autolisi e autocitolisi che portano alla necrosi del campione. Per questo motivo i tessuti

osservati a fresco, devono essere messi in una soluzione che eviti l'essicazione del preparato. Si usano

soluzioni fisiologiche, o soluzioni saline isotoniche con ioni Ca e Mg.

Possiamo in parte cercare di migliorare il contrasto usando coloranti detti vitali, nel senso che possono essere

assorbiti dalle cellule senza alterarle e senza provocare tossicità, un buon compromesso per avere maggiore

contrasto e vedere meglio le cellule. Normalmente si usa per cellule con vacuoli.

- VETRINO ISTOLOGICO: Prevede la colorazione detta sopravitale.

Allestimento di un vetrino classico di base

L'allestimento di un vetrino istologico comprende diverse fasi:

1. PRELIEVO: la prima cosa da fare è il prelievo. Facciamo l'esempio di un chirurgo, che sta facendo un

intervento su un paziente, e ha il sospetto che un tumore abbiamo colpito un organo: il chirurgo, mentre fa

l'intervento, sia questo esplorativo o di asportazione etc. preleva 1 cm di tessuto, effettuando quindi una

biopsia (in alternativa si usano anche le agoaspirazioni), e lo prepara per sapere se c'è un tumore, quanto è

grave, che tipo di tumore è eccetera. È importante dare un risultato il più possibile attendibile, facendo un

vetrino.

2. FISSAZIONE: il primo passaggio da fare dopo il prelievo è la fissazione, in cui cerchiamo di fissare la nostra

biopsia in un momento più possibile uguale al momento in cui il tessuto era attaccato all'organo: più tempo

passa, più si manifestano alterazioni autolitiche e citolitiche. I pezzi da fissare non devono superare 1 cm: più il

prelievo è grosso, più è difficile da fissare. Una volta che il chirurgo ha preso il campione, lo seziona, lo lava in

soluzione fisiologica e lo fissa. La fissazione normalmente la fa il chirurgo, in modo che passino pochi secondi

dall'espianto alla fissazione, perché quest'ultima blocca l'attività degli enzimi, blocca i batteri, il tutto in un

momento simile a quando il campione era attaccato all'organismo. Quindi in questo modo i fenomeni citolitici

vengono evitati il più possibile. Vi sono 2 possibilità di conservazione di base della biopsia, una chimica e una

fisica. Vanno bene entrambe, ma normalmente si fa quella chimica perché è più semplice e più facile, ma

anche quella fisica potrebbe essere utile. - Fissazione chimica; prevede l'uso di fissativi, che sono agenti

stabilizzanti in grado di instaurare legami cross-linked tra le proteine. Il tessuto, se è troppo grande, fa si che il

fissativo penetri solo nelle parti più esterne, e nel momento in cui andremo a tagliarlo, vedremo che

esternamente abbiamo ottenuto il risultato, internamente no, e non lo potremo usare. Si dividono in 2 grosse

categorie: quelli che coagulano come alcol etilico e acido acetico, e quelli che non coagulano, come la

formalina. Alcuni sono più usati per la microscopia elettronica, e altri più usati in microscopia ottica;

cambiano perché la preparazione di un vetrino per la microscopia ottica è diversa da un retino per la

microscopia elettronica. Tra tutti, quello più usato e più conosciuto è la formalina, cioè l'aldeide formica al

10%. È un fissativo buono, non ottimo ma va bene praticamente per tutti i tipi di tessuti. In microscopia

elettronica, i più usati sono l'acido osmico, in particolare il tetrossido osmico, e la glutaraldeide. Abbiamo

anche miscele di fissativi, che prendono nomi di scienziati che le hanno collaudate.

Fissazione fisica si basa sull'utilizzo delle basse temperature, -20 gradi per esempio, oppure prevede

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l'uso di azoto liquido, e non è di facile attuazione. Alla fine, questa fissazione sarebbe la migliore, perché

non cerchiamo di alterare il tessuto con sostanze. Quella fisica è migliore anche se vogliamo vedere i

lipidi, che normalmente con la fissazione chimica classica tendono a rovinarsi e deteriorarsi, e quindi non

sempre saranno visibili. Quindi se dobbiamo andare ad individuare una patologia che lega lipidi, è meglio

usare la fissazione fisica.

3. DISIDRATAZIONE: Abbiamo detto che abbiamo fissato il preparato in formalina, ad esempio, e lo

conserviamo per dei giorni. Una volta che il preparato è fissato, dovremo vedere il vetrino al microscopio, e

dovremo colorarlo. Non solo! Dobbiamo ottenere sezioni sottili di 5-20 micron, quindi dovremo tagliarlo con il

microtomo; per essere tagliato, il preparato deve essere solido, quindi dovremo fare l'inclusione in paraffina. Il

punto è che la paraffina (la sostanza di inclusione più usata) non è solubile in acqua; quindi, dobbiamo far si

che il preparato non contenga più acqua. Quindi dopo la fissazione, avviene la prima serie ascendente degli

alcoli: partiamo da delle concentrazioni basse di alcol, per esempio al 50%, passiamo poi in soluzioni sempre

più alcoliche (70%, 80%, 95%) e infine passiamo il campione due volte in alcol assoluto. Lo scopo finale è

togliere l'acqua, cioè, disidratare il campione per poterlo includere in paraffina. È un processo non rapidissimo,

perché il campione è ancora "grezzo", e spesso quindi deve stare un per tot di tempo nella serie ascendente.

Diciamo che più ci sta meglio è, così l'alcol può compenetrare meglio (a volte lo si lascia overnight).

4. DIAFANIZZAZIONE: a questo punto, per rendere il preparato solubile in paraffina, si fa un passaggio in Xilolo,

in modo che sia totalmente compatibile con la paraffina.

5. INCLUSIONE: a temperatura ambiente, la paraffina è solida. Perciò si scalda da 50 a 70 gradi, e quando è

ancora calda, si versa sul campione; se il campione è stato fissato bene, ed è stata fatta bene l'essicazione, la

paraffina compenetra nella biopsia fino all'interno, poi si solidifica e forma un blocchetto che possiamo

inserire nella morsa del microtomo per ottenere delle sezioni.

6. TAGLIO AL MICROTOMO: il microtomo ha una lama, una morsa e una scala dei micron. Volgarizzando la

cosa lo possiamo paragonare ad una affettatrice. Facciamo scorrere la base su una slitta con la lama, che

passa sul campione, e ogni volta viene fatta una sezione spessa quanto vogliamo, lo decidiamo noi con la

scala dei micron. Facciamo di base sezioni seriate, cioè più sezioni, perché ci serve avere la tridimensionalità

del preparato.

7. REIDRATAZIONE: mettiamo le sezioni in vetrini, fatti con un vetro abbastanza spesso, circa mezzo cm, in cui

abbiamo una parte più trasparente e una più satinata per poterci scrivere. Questo vetrino adesso dobbiamo

colorarlo, ma abbiamo un problema: tutti i coloranti sono fatti di acqua! Noi l'abbiamo tolta con la serie

ascendente degli alcoli, quindi dobbiamo rimediare e fare il processo inverso. Prima trattiamo il campione con

Xilolo, e poi effettuiamo la serie discendente degli alcoli: da alte concentrazioni alcoliche fino a basse

concentrazioni. La differenza è che, se prima avevamo un campione molto spesso, adesso abbiamo delle

sezioni; quindi, non è necessario lasciare il preparato overnight.

8. COLORAZIONE: adesso lo possiamo colorare! Esistono una marea di coloranti, e funzionano più o meno tutti

tramite instaurazioni di legami elettrostatici con ciò che dobbiamo vedere; quindi, abbiamo coloranti acidi,

basici e neutri: Il colorante acido, o basofilo (eosina, orange G verde luce), va a legarsi a una base mentre il

colorante basico, o acidofilo (ematossilina, tionina, pironina, azzurro B), va a legarsi all'acido. Possiamo usarne

anche più di uno, anche 4 insieme! Vediamo la colorazione più semplice, ematossilina-eosina (EE). È una

colorazione dicromica combinata e serve per evidenziare la cellula, in particolare il nucleo, perché i contorni

cellulari non si vedono mai, e per capire se ci sono molte cellule vicine, si evidenziano i nuclei. L'ematossilina

è un colorante basico blu e colora i nuclei, l'eosina è un colorante acido rosa/orange e colora il citoplasma,

perché ricco di proteine basiche. Le colorazioni sono molteplici e diverse da tessuto a tessuto, ma in linea di

massima il tessuto epiteliale si colora di rosa (non sempre ma quasi) il connettivale e il muscolare invece li

vediamo blu. Non c'è una legge, di base si seguono certe linee e quindi, in una buona percentuale di casi

vediamo queste colorazioni per i vari tipi di tessuto.

9. OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO

10. CONSERVAZIONE DEL VETRINO: normalmente si fa qualcosa per conservare il vetrino e farlo durare il più a

lungo possibile; quindi, lo proteggiamo tramite delle resine solide che vengono versate sopra il preparato.

10 a) Seconda disidratazione: le resine utilizzate per la conservazione, non sono solubili in acqua e quindi

rifacciamo la serie ascendente degli alcoli.

10 b) Uso della resina: una volta disidratato mettiamo la resina. (Un tempo si usava il balsamo del Canada che

veniva fatto dalla resina fatta dagli alberi).

10 c) Copertura con vetrino copri-oggetto: mettiamo sopra il vetrino copri-oggetto, un vetrino più piccolo,

normalmente quadrato, che appoggiamo sopra il campione; normalmente occupa solo la porzione dove è

presente il campione ed è sottilissimo, per non interferire con l'osservazione al microscopio, cioè per non

avere fenomeni di rifrazione quando lo osserviamo nuovamente.

Striscio di sangue

Lo striscio di sangue, si usa nella pratica medica perché il sangue è l'unico tessuto che possiamo, a seconda delle

analisi, osservare senza colorare il preparato. Si prende un vetrino, si mette la goccia di sangue, l'altro vetrino lo si

mette oltre la goccia, con una angolazione di 30 gradi e si porta indietro fino a prende la goccia di sangue che si

espanderà. Si porta avanti il vetrino superiore sul sottostante, si forma lo striscio, e si può subito osservare al

microscopio. Si riescono a differenziare gli eritrociti dai leuciti, ad esempio, perché sono i globuli rossi sono pallidi e

senza nucleo; non si può capire il tipo di leucociti presenti o differenziare tra monociti, piastrine et. ma è possibile

capire più o meno, quanti eritrociti e leucociti sono presenti; quindi, posso avere una prima visione dell'ematocrito.

Questa è l'unica possibilità di poter guardare un vetrino senza averlo prima colorato.

TESSUTO EPITELIALE

[Organi cavi e organi pieni, generalità sul tessuto epiteliale, caratteristiche delle cellule

epiteliali, generalità sugli epiteli di rivestimento, epiteli di rivestimento semplici. ]

ORGANI CAVI E ORGANI PIENI

Nel corpo umano, possiamo classificare gli organi, che formano sistemi e apparati, in due grandi

categorie: organi cavi e organi pieni; ORGANI CAVI;

Gli organi cavi, sono formati da una parete, costituita dalla sovrapposizione di tonache, che circoscrive

un lume, cioè una cavità. Le tonache che costituiscono la parete, sono differenti a seconda che si parli

di organi cavi viscerali (come stomaco, intestino, esofago ecc), o di organi cavi dell'apparato

cardiocircolatorio (vasi e cuore). TONACHE DEI VISCERI CAVI

Quando si parla di un organo cavo, si parte dalla tonac