Isolamento di DNA plasmidico

Isolamento di DNA plasmidico e profili di restrizione

Martedì 9 marzo 2021

Espressione di proteine ricombinanti

(riassunto)

• Normalmente il DNA clonato in un vettore di clonaggio viene mantenuto in un ceppo di mantenimento di E. coli, come DH5α.
• Per esprimere la proteina codificata dal DNA clonato, il gene viene subclonato in un vettore di espressione, cioè un plasmide che contiene un promotore e tutte le sequenze necessarie per l’espressione del DNA → questo doppio passaggio può essere eliminato con l’uso di un unico vettore definito vettore navetta.
• Il subclonaggio (subclonare= effettuare degli spostamenti o delle modifiche su DNA che è già stato clonato) può essere effettuato tagliando con opportuni enzimi di restrizione sia il vettore che il gene, oppure mediante PCR.
• Un ceppo di E. coli di espressione - es. E. coli BL21(DE3) - viene trasformato con il plasmide di espressione ricombinante.
• Tutte le volte che ottengo vettori di clonaggio, eseguo operazioni di subclonaggio o utilizzo una PCR, mi occupo di estrarre il DNA plasmidico ed eseguire su di esso delle modifiche → lo devo amplificare per disporre di una quantità di DNA da manipolare. Devo estrarlo, verificarne il grado di purezza, essere sicura che una mutagenesi o la sostituzione di una regione codificante per un intero dominio della proteina, siano effettivamente avvenuti.

Estrazione ed isolamento di plasmidi di clonaggio o di espressione

• Una volta avvenuta la selezione (mediante agente di selezione come un antibiotico) e l’espansione di cloni positivi, isolo il DNA plasmidico.
• Le procedure di estrazione di DNA plasmidico si basano su procedure di isolamento selettivo di plasmidi di clonaggio/espressione → bisogna separare il DNA plasmidico dal DNA cromosomale della cellula.
• Si fanno quindi le colture in test tube (espando la colonia) → le cellule avranno raggiunto una densità tale da saturare il terreno.
• Le colture vengono prelevate dal tubo in cui è avvenuta la coltivazione e trasferita in un tubo (col tappo blu nell’immagine) adatto ad essere sottoposto ad una centrifugazione → per separare le cellule dal terreno di coltura (le ottengo in forma di sedimento).
• Le cellule nel sedimento vengono risospese in un volume più piccolo di un liquido alcalino cioè una soluzione che contiene NaOH (soda). La funzione del liquido è quella di produrre la lisi delle cellule → si produce cioè un lisato cellulare e contemporaneamente si verifica la denaturazione del DNA.

Denaturazione e separazione

Nell’ambiente extracellulare si riversano componenti proteiche, DNA cromosomale e DNA plasmidico. Gli ultimi due vengono denaturati perché perdono la conformazione a doppio filamento.

Le proteine subiscono una denaturazione irreversibile → perdono il loro fold nativo che permette di mascherare residui di tipo idrofobico che si trovano all’interno del core idrofobico. Quando avviene la denaturazione avviene l’esposizione di questi residui che tenderanno ad agire l’uno con l’altro e ad addensarsi per escludere le molecole di acqua. Questo comporta un effetto di flocculazione delle proteine (soluzione che contiene proteine che stanno denaturando ad alta densità) con la formazione di fiocchi visibili anche ad occhio nudo.

• Questi flocculi possono essere separati dal DNA attraverso una nuova centrifugazione e l’aggiunta di una soluzione acida (acido acetico). Il rapporto con cui viene aggiunto