Isolamento di DNA plasmidico

ISOLAMENTO DI DNA PLASMIDICO E

PROFILI DI RESTRIZIONE

Martedì 9 marzo 2021

Espressione di proteine ricombinanti

(riassunto)

Normalmente il DNA clonato in un vettore di clonaggio viene

 mantenuto in un ceppo di mantenimento di E. coli, come DH5α

Per esprimere la proteina codificata dal DNA clonato, il gene

 viene subclonato in un vettore di espressione, cioè un plasmide

che contiene un promotore e tutte le sequenze necessarie per

l’espressione del DNAquesto doppio passaggio può essere

eliminato con l’uso di un unico vettore definito vettore navetta.

Il subclonaggio (subclonare= effettuare degli spostamenti o

 delle modifiche su DNA che è già stato clonato) può essere

effettuato tagliando con opportuni enzimi di restrizione sia il

vettore che il gene, oppure mediante PCR

Un ceppo di E. coli di espressione - es. E. coli BL21(DE3) - viene

 trasformato con il plasmide di espressione ricombinante

Tutte le volte che ottengo vettori di clonaggio, eseguo

 operazioni di subclonaggio o utilizzo una PCR, mi occupo di

estrarre il DNA plasmidico ed eseguire su di esso delle

modifiche lo devo amplificare per disporre di una quantità di

DNA da manipolare. Devo estrarlo, verificarne il grado di

purezza, essere sicura che una mutagenesi o la sostituzione di

una regione codificante per un intero dominio della proteina,

siano effettivamente avvenuti.

Estrazione ed isolamento di plasmidi di

clonaggio o di espressione

Una volta avvenuta la selezione (mediante agente di selezione

 come un antibiotico) e l’espansione di cloni positivi, isolo il DNA

plasmidico.

Le procedure di estrazione di DNA plasmidico si basano su

 procedure di isolamento selettivo di plasmidi di clonaggio/

espressione bisogna separare il DNA

plasmidico dal DNA cromosomale della cellula.

Si fanno quindi le colture in test tube (espando la colonia) le

 cellule avranno raggiunto una densità tale da saturare il terreno.

Le colture vengono prelevate dal tubo in cui è avvenuta la

 coltivazione e traferita in un tubo (col tappo blu nell’immagine)

adatto ad essere sottoposto ad una centrifugazione per

separare le cellule dal terreno di coltura (le ottengo in forma di

sedimento).

Le cellule nel sedimento vengono risospese in un volume più

 piccolo di un liquido alcalino cioè una soluzione che contiene

NaOH (soda). La funzione del liquido è quella di produrre la lisi

delle cellule si produce cioè un lisato cellulare e

contemporaneamente si verifica la denaturazione del DNA.

Nell’ambiente extracellulare si riversano componenti proteiche,

DNA cromosomale e DNA plasmidico. Gli ultimi due vengono

denaturati perché perdono a conformazione a doppio filamento.

Le proteine subiscono una denaturazione irreversibile perdono

il loro fold nativo che permette di mascherare residui di tipo

idrofobico che si trovano all’interno del core idrofobico. Quando

avviene la denaturazione avviene l’esposizione di questi residui

che tenderanno ad agire l’uno con l’altro e ad addensarsi per

escludere le molecole di acqua. Questo comporta un effetto di

flocculazione delle proteine (soluzione che contiene proteine

che stanno denaturando al alta densità) con la formazione di

fiocchi visibili anche ad occhio nudo.

Questi flocculi possono essere separati al DNA attraverso una

 nuova centrifugazione e l’aggiunta di una soluzione acida (acido

acetico). Il rapporto con cui viene aggiunto