Genetica molecolare

Genetica molecolare umana II anno - II sem

Progetto genoma umano – HGP

Lezione 1 Prof.ssa Marozzi

L’idea nasce negli anni ’80 dopo:

• 1953 Watson, Crick determinano la struttura del DNA.
• 1977 Maxam, Gilbert e Sanger mettono a punto 2 diversi metodi per sequenziare il DNA.
• 1985 Mullis inventa la PCR, tecnica che permette di moltiplicare artificialmente il DNA anche se presente in quantità minime.

Nel 1986 nasce l’idea da un gruppo di scienziati che lavoravano negli Stati Uniti, tra i quali Renato Dulbecco, lo scopo era sequenziare il genoma umano per sconfiggere il cancro.

I fondi per il progetto, 5.3 milioni di dollari, sono stanziati dal NIH (National Institute of Health) e DOE (Energy Department), enti americani.

Nel 1990 viene istituito da James Watson il consorzio internazionale HGP e vengono stanziati 3 miliardi di dollari in 15 anni coinvolgendo diversi laboratori nel mondo (un cromosoma assegnato ad ogni stato).

In Italia il progetto nasce nel 1987 ma si interrompe nel 1995, il cromosoma assegnato era il chr Y, molto breve, con pochi geni.

Il progetto U.S. Human Genome Project inizia quindi formalmente nel 1900 e doveva terminare in 15 anni ma lo sviluppo tecnologico ha permesso di accelerare le tappe e nel 2003 si termina (99%) il sequenziamento della parte eucromatica del genoma.

Gli obiettivi sono:

• Identificare tutti i geni contenuti nel DNA umano.
• Determinare la sequenza delle 3 miliardi di basi che compongono il DNA umano.
• Sviluppare tecnologie di sequenziamento più rapide ed economiche.
• Catalogare le informazioni in database informatici.
• Sviluppare programmi per l’analisi delle sequenze.
• Rispondere ai quesiti etici, legali, sociali legati allo svolgimento del progetto.

Con lo sviluppo del sequenziamento Sanger automatico (fluorescente con sequenziatore capillare) è stato possibile sequenziare in modo massivo il genoma.

Il primo sequenziatore era mono-capillare, poi diventarono a 16 capillari (potevano essere sequenziati 16 campioni in contemporaneamente), poi a 37, 400.000 basi in un giorno. Questa “evoluzione” ha permesso di sequenziare 94. Oggi usato NGS.

Importante è stata anche la riduzione dei costi nel tempo: nel 1985 il costo per base era di 10 dollari, nel 2006 meno di 0,001.

Ricadute del progetto HGP

Ricadute del progetto HGP:

Nella ricerca di base:

• Meccanismi biochimici e molecolari alla base della biologia della cellula.
• Biologia dello sviluppo.
• Ricerche antropologiche.

Medicina molecolare e malattie ereditarie:

• Diagnosi e trattamento delle malattie ereditarie e dei tumori.
• Identificazione di circa 5000 malattie ereditarie monogeniche.

Il HGP si svolse contemporaneamente su due “binari” differenti, pubblico e privato.

Nel 1992 Craig Venter lascia l’NIH e il progetto pubblico per fondare nel 1998 una company privata, la Celera Genomics che si occupa di sequenziamento del genoma.

1993 Collins e Sulston diventano direttori del National Human Genome Research Center negli USA e nel Sanger Center in UK (tra i principali centri coinvolti nel HGP).

Inizialmente il HGP era un lavoro molto complicato e venne sequenziato solo il 2% dal 1989 al ’97.

Prima vennero definite alcune sequenze la cui posizione era nota nel genoma, poi iniziarono ad integrare le informazioni e proseguirono in modo molto più specifico e dettagliato.

I primi due cromosomi sequenziati furono il 21 e 22, i più piccoli. La loro sequenza completa fu pubblicata rispettivamente su Nature e Science nel 1999 e 2000.

Per pubblicare la bozza completa fu necessario l’intervento di Bill Clinton che impedì a Celera di brevettare il genoma. Nel 2001 su Nature e Science, in contemporanea, vennero pubblicati i dati in modo da evitare competizioni.

Nel 2001 il genoma non era sequenziato completamente, con gli anni si stanno completando i gap ma ancora oggi parte del genoma non è sequenziato → il genoma altamente ripetuto (centromeri, telomeri…).

Ufficialmente il completamento della sequenza del genoma umano è stato nel 2003.

Il genoma contiene 6 miliardi di basi ed è lungo circa 1,5 m contenuto in un nucleo di 5 micron.

Il mappaggio genetico (distanza di una sequenza da un’altra, centiMorgan, legato alla frequenza di ricombinazione di una regione) è stato il primo approccio per poter posizionare alcune sequenze sul genoma.

Vennero utilizzati due approcci per il sequenziamento:

• Metodo gerarchico (HGP-pubblico).
• Whole genome shotgun (Celera-privato).

Sequenziamento shotgun e gerarchico

Il sequenziamento shotgun inizia rompendo con enzimi di restrizione, poi sonicando il genoma (con onde d’urto), usando il clonaggio in plasmidi (per avere dei primer da cui iniziare la reazione di sequenza), poi vennero sequenziati tutti i pezzetti → alcune sequenze risultarono in over-lapping (sovrapposti) e con algoritmi vennero messi insieme e posizionate sul genoma correttamente (grazie al mappaggio precedentemente fatto).

Il sequenziamento gerarchico si basa sulla produzione dei contigui (cloni in over-lapping per i terminali), è un lavoro più lungo.

Una volta mappati, dato il locus, vennero scelti alcuni contigui, tagliati, clonati e sequenziati.

Per creare una mappa è necessario disporre di una libreria di DNA:

• Taglio con enzimi di restrizione (parziale in modo da creare frammenti sovrapposti) → necessari almeno 6/7 cloni di ogni pezzo di DNA.
• Per la digestione parziale si mette a contatto DNA ed enzima per poco tempo oppure si aggiunge a circa 65 °C un inibitore dell’enzima come l’EDTA che blocca il processo.
• Clonaggio. I primi vettori usati furono gli YAC (ma non sequenziabili: decresce a 30 °C, difficile estrarre DNA, tendono a ricombinare…), ma hanno un’origine di replicazione bassa → poi i PAC e i BAC (100/130 Kbasi producono meno DNA ricombinante e questo permette il clonaggio di sequenze instabili).
• Si ordinano i cloni di DNA con inserti che si sovrappongono (contigui).
• Si crea una mappa fisica completa di regioni di cromosoma per arrivare alla sequenza completa di DNA.
• Il sequenziamento shotgun poi è fatto all’interno di un singolo contiguo.

→ Sequenziamento HGP più lento perché a due fasi. Sono usati grandi vettori per suddividere i cromosomi in grandi contigui.

→ Assemblaggio più facile → Libreria instabili → Mappaggio spesso difficile → Librerie di subcloni necessarie.

→ Whole Genome Shotgun più veloce ma grande lavoro informatico. Il genoma è frammentato in larga scala, ciascun frammento è sequenziato e poi l’allineamento avviene con l’uso di supercomputer.

→ Una fase sola → Costruzione di poche librerie.

Una volta sequenziato il genoma è necessario annotarlo in banca dati, cioè registrare: posizione dei geni, struttura esoni-introni, inizio e termine della trascrizione, posizione regioni di controllo, eventuali splicing alternativi, sequenza delle proteine codificate, profili di espressione, funzioni biologiche, identificazione di geni ortologhi (presenti in specie diverse e derivanti da un gene ancestrale comune) e paraloghi (formatisi in seguito a duplicazione nell'ambito di una stessa specie), sequenze ripetute, polimorfismi.

Risultati di HGP:

• Sequenziamento e mappaggio genoma umano e organismi modello.
• Identificazione di geni e sequenze potenzialmente codificanti.
• Sviluppo di tecnologie di analisi dedicate.
• Studio implicazioni etiche, sociali, legali.
• Diffusione dei dati attraverso database pubblici.

→ Sviluppi del HGP fase post-genomica:

• Studio della funzione dei geni e del DNA non codificante.
• Meccanismi di controllo dell'espressione genica a livello trascrizionale, traduzionale e post-trascrizionale.
• Studio delle interazioni tra proteine.
• Identificazione della conservazione evolutiva delle funzioni biologiche.
• Studio delle variazioni del DNA e suscettibilità alle malattie.
• Identificazione di geni coinvolti nelle malattie poligeniche.
• Genetica dello sviluppo e cellule staminali.

Riguardo le implicazioni etiche, legali e sociali è stato fondato l’ELSI, è un ente che controlla la gestione dei dati: chi può avere accesso alle informazioni genetiche personali e come possono essere usate? Chi conserva e controlla i dati? I geni possono influenzare lo stile di vita? Chi può ottenere e manipolare il DNA?...

ENCODE è un progetto che si è prefissato di studiare tutto ciò che concerne l’espressione dei geni, quindi le parti funzionali di questi (elementi regolatori come enhancer, repressori, silencer; promotori). Per farlo sono state utilizzate diverse tecniche come la ChIP-Seq, RT-PCR, l’RNA-Seq…

I dati ricavati: l’annotazione genica, l’analisi di trascrittomica, della cromatina, del legame dei fattori di trascrizione, metilazioni ecc…, dopo la verifica e l’analisi sono stati salvati e resi accessibili su banche dati pubbliche (es.: NCBI…).

Organizzazione del genoma umano

Lezione 2

L’uomo è formato da circa 10^14 cellule → ciascuna formata da un genoma nucleare (99% del DNA totale cellula) e moltissimi genomi mitocondriali (cellula uovo matura è quella con più mitocondri in assoluto).

Il genoma nucleare è composto da 6x10^9 coppie di basi, suddivise in 23 coppie di molecole lineari: i cromosomi.

I cromosomi sono diversi: alcuni più grandi altri più piccoli da 250 mila bp a 50 mila → non c’è una correlazione diretta tra grandezza in termini di bp e numero di geni. Il DNA nucleare è molto lungo (1,5 m) e l’associazione con proteine istoniche e non permette l’impacchettamento nel nucleo.

Il DNA mitocondriale non ha proteine associate → la frequenza di comparsa di mutazioni maggiore.

Il numero di geni codificanti nel genoma mitocondriale in proporzione è molto maggiore di quello nucleare che è “povero” in geni.

→ La stima corrente (negli anni è stata continuamente diminuita in seguito a nuove scoperte) è che il genoma nucleare contenga 20.000 geni codificanti.

Il genoma contiene molti pseudogeni = “copie non funzionali di geni”.

Ci sono casi in cui quando due geni sono molto vicini (congiunti) può avvenire una specie di trascrizione continua dando origine ad un trascritto unico → read-through. Questi trascritti spesso danno origine a RNA non codificanti funzionali.

→ Quantificare precisamente il numero di geni nel DNA non è semplice.

RNA non codificanti

Gli RNA non codificanti sono distinti in long non coding e piccoli RNA: nella classe dei piccoli RNA nc si trovano 4 classi di RNA espressi in modo ubiquitario.

Ci sono altri piccoli RNA che svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dell’espressione genica → (miRNA, siRNA, piRNA) target specifici solitamente in funzione del tessuto e del tempo.

I long nc RNA sono distinti in nucleari e citoplasmatici:

• Nucleari: RNA con relazioni con complessi che intervengono nell’interazione con il genoma, RNA antisenso che possono inibire l’espressione del gene in cis e trans…
• Citoplasmatici: sono processati per dare origine a un trascritto maturo, agiscono sui meccanismi di traduzione, sulle proteine.

Gli RNA sono coinvolti in:

• Sintesi proteica ed esportazione (mRNA, rRNA, tRNA).
• Maturazione dell’RNA (snRNA, snoRNA…).
• Sintesi del DNA (U1, U2 snRNA, TSIX…).
• Regolazione genica (piRNA…).
• Controllo di trasposoni.

La difficoltà nell’identificare gli RNA non codificanti e quindi dei geni per gli RNA funzionali dipende da:

• Mancanza ORF (open reading frame).
• Poco conservati → “una sequenza è conservata se si deve produrre una proteina” di solito, i ncRNA svolgono una funzione regolatoria sull’espressione genica che può non dipendere strettamente dalla sequenza.
• La struttura secondaria stem-loop è fondamentale e questa solitamente è conservata.
• Lunghezza → miRNA sono circa di 100 bp.

→ È possibile che i geni a RNA siano molti di più ma mancano gli strumenti per trovarli.

Densità genica

Densità genica: la % di GC (media 41,5% poi varia a seconda del chr) indica la quantità di geni presenti in un determinato cromosoma perché sono presenti nelle isole CpG, nei promotori.

Nei chrs c’è sempre una quota di eterocromatina fissa → centromero e altre regioni in alcuni cromosomi.

→ La quantità di eterocromatina non è direttamente correlata con il contenuto in GC o la lunghezza.

Il genoma nucleare ha una densità genica molto bassa di circa 1 gene ogni 80 Kb.

Il n° di geni codificanti stimato nel genoma umano (20.000) è stato stimato utilizzando il sequenziamento genomico e CpG.

L’esperimento usato è stato un’ibridazione in situ fluorescente FISH. I chr metafasici sono stati ibridati con una sonda corrispondente a una frazione purificata di isole CpG marcata con un fluorocromo Texas Red rosso.

I chr sono verdi perché è stato usato un marcatore che si intercala tra le basi e permette di vedere il DNA che si replica tardivamente. → Alcuni chr risultano molto più rossi di altri la distribuzione del colore rosso non è uniforme, tendenzialmente è più telomerica la posizione dei geni.

• Utilizzando le sonde per CpG (56% dei geni umani hanno nei loro promotori questi elementi di sequenza) si è visto una differente densità genica su cromosomi:
• Cromosoma 19 ricco in geni.
• Cromosomi 4 e 18 poveri in geni.
• Le regioni subtelomeriche hanno il maggior contenuto di geni.
• Ci sono geni in unica copia →
• Possono appartenere a famiglie geniche originatesi per duplicazione si possono così mantenere funzioni correlate e si possono mappare nella stessa regione genomica.

I geni umani codificanti per una proteina possono avere organizzazioni diverse e andare incontro più o meno a mutazioni.

La lunghezza media dei geni è di 64 Kb. È più facile che venga mutato un gene più lungo.

→ Non necessariamente un gene più lungo (n° esoni) corrisponde da una proteina più grande (es.: distrofina: gene più grande in assoluto con 79 esoni ma codifica per una proteina di soli 900 KDa).

→ Gli esoni mediamente hanno lunghezza di 150 nt mai lunghi perché altrimenti avrebbero maggiori probabilità di mutazioni. È un tentativo di conservare la sequenza.

→ Inoltre, gli esoni codificano per un piccolo dominio della proteina non necessario averli lunghi.

→ La grandezza del gene non è direttamente funzione del numero di esoni ma dipende dal numero degli introni.

→ Più un gene è lungo più sarà necessario tempo per trascriverlo. → La lunghezza è correlata al grado di espressione, i geni per proteine necessarie in grandi quantità sono più breve e vengono trascritti più velocemente.

Es.: i geni codificanti per le proteine istoniche sono molto brevi e prodotto velocemente, quello per la distrofina necessaria in piccole quantità è molto lungo.

→ Spesso nei genomi di organismi semplici o nei mitocondri si possono trovare altri geni all’interno di geni.

Nei mammiferi sono descritti geni contenuti in grandi introni di alcuni geni. A differenza dei genomi più semplici in questi casi viene usato il filamento opposto al gene “canonico” (filamento antisenso).

→ Si sfrutta la possibilità di produrre a partire da un introne più proteine.

Spesso gli RNA funzionali si trovano all’interno degli introni sul filamento senso, sono trascritti tutti insieme e poi sono tagliati.

→ Da un unico gene espresso si producono più RNA.

→ Lo stato di conservazione durante l’evoluzione: le sequenze codificanti (per proteine) sono le regioni più conservate.

Eterocromatina (seq altamente ripetute in tandem) e trasposoni (seq ripetute intersperse) poco conservati.

→ Il 30% del DNA nucleare è correlato a geni non necessariamente codificante (solo 3% del totale).

Del 70% del DNA extragenico, il 20% è DNA ripetuto (altamente e in tandem e intersperse).

Organizzazione introni-esoni e famiglie geniche

L’organizzazione introni-esoni.

La maggior parte dei geni è organizzata in famiglie geniche. Dei diversi membri della famiglia è di solito identica → derivazione da un singolo gene ancestrale.

Classificazione funzionale del genoma umano:

• Nel DNA umano solo il 25% dei geni è presente in singola copia.
• DNA spacer →
• DNA ripetuto con sequenza funzionali che comprendono famiglie di geni codificanti:
• Geni ripetuti in tandem.
• Geni intersperse.

Il 50-70% dei geni umani è costituita da membri di famiglie di sequenze di DNA che condividono tra loro un buon grado di omologia.

Questi si trovano facendo analisi di: ibridazione molecolare, sequenziamento di DNA, PCR.

Es.: Southern Blot, si prende un esone come sonda.

Ibridando con quell’esone e si taglia il DNA con EcoRI si avrà una banda da tot Kb → si ottengono due bande diverse → l’esone è condiviso da un’altra regione del DNA.

Perché esistono le famiglie geniche? Qual è il loro scopo?

• Duplicando un gene si produce più prodotto per grandi richieste di prodotto.
• Funzioni specializzate.
• Espressione differenziale.

Le famiglie sono classificate per omologia di sequenza (familiarità, quanto sono simili) e per l’organizzazione (in tandem, intersperse).

1. Famiglie di geni ripetuti

L’unità di trascrizione è ripetuta in tandem da 1-3 copie fino a 140 in cinque raggruppamenti (clusters), localizzati sul braccio corto dei cromosomi acrocentrici (50 unità ripetute in tandem per raggruppamento).

Es.: geni per rRNA

2. A. Famiglie geniche classiche in