Ecologia del microbiota umano

ECOLOGIA DEL MICROBIOTA UMANO

ESAME: 10 domande ( 5 per programma) ogni domanda vale 3 punti e per ogni domanda ci sono 6 minuti

I PROCARIOTI

I batteri sono procarioti, fanno parte del microbiota umano, con funghi, e sono i più studiati.

I procarioti sono nati 3,5 miliardi di anni fa. Hanno avuto moltissimo tempo e moltissime influenze, molto più

rispetto all’uomo; quindi, è stato più facile acquisire cambiamenti di funzione di forma, ecc., infatti molti

batteri del nostro microbiota hanno funzioni che dobbiamo ancora scoprire.

I procarioti sono organismi unicellulari caratterizzati dall’assenza di un vero nucleo e di organelli delimitati

da membrana (come mitocondri, cloroplasti, ecc.).

I batteri, infatti hanno il DNA libero nel citoplasma, raccolto in una regione detta nucleoide; possiedono

ribosomi (ma più piccoli di quelli degli eucarioti); sono circondati da una membrana plasmatica e spesso

da una parete cellulare; si riproducono per scissione binaria.

Insieme agli Archaea, i batteri costituiscono i due grandi domini dei procarioti.

L’essere umano è deNnibile come un OLOBIONTE, ovvero un sistema costituito da cellule eucariotiche

(10 ) e procariotiche (1.2 * 10 ). La presenza di una popolazione procariotica e virale permette di

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regolare la normale Nsiologia e funzionalità.

Un olobionte è un concetto biologico che si riferisce a un organismo costituito non solo dal suo ospite

principale, ma anche dalla comunità di microorganismi che vive in simbiosi con esso. Questa comunità può

includere batteri, virus, funghi e altri microorganismi. È considerato un’unità funzionale, in cui l’ospite e il suo

microbiota interagiscono in modi complessi e influenzano reciprocamente la salute e le funzioni

dell’organismo nel suo complesso.

La cellula pre-eucariotica non aveva la stessa struttura di oggi, ha avuto un’invasione endocitotica di un

batterio molto performante nel produrre energia tramite la respirazione aerobica, quest’ultimo invece di

essere digerito, si instaura una relazione simbiotica ed è diventato quello che noi consociamo come

mitocondrio: TEORIA DI LYNN MARGULIS ENDO-SIMBIOSI. Una seconda endosimbiosi: una cellula

eucariotica già dotata di mitocondrio ingloba un cianobatterio fotosintetico, il cianobatterio perde autonomia

e diventa il cloroplasto, dando origine alla cellula vegetale (della pianta).

La teoria dell'endo-simbiosi, postulata dalla biologa Lynn Margulis, ipotizza che le cellule eucariote che

costituiscono i mattoni del mondo animale e vegetale, si siano evolute a seguito della fusione con cellule

procariote

LA CLASSIFICZIONE DEI VIVENTI

La classiNcazione dei viventi è la modalità con la quale gli esseri viventi vengono organizzati in gruppi in

base alle loro caratteristiche e relazioni evolutive. Negli anni sono state sviluppate diverse modalità di

classiNcazione

La classiHcazione dei 5 regni di WHITTAKER = è composto da 5 REGNI basato su una

- distinzione strutturale, sulla organizzazione e nutrizionale:

• MONERA= l’unico regno formato da soli procarioti

• PROTISTI= eucarioti unicellulari

• FUNGHI= eterotroN per assorbimento

• PIANTE=autotroN fotosintetici

• ANIMALI=eterotroN per ingestione

La classiHcazione a 3 domini e 6 regni di WOESE= introduce il concetto di dominio (o impero) e

- ne distingue 3 domini:

1. BACTERIA

2. ARCHEA

3. EUCARYA

Nei 3 domini si riconoscono 6 regni: i bacteria, archea, protisti, piante, funghi e animali

La TASSONOMIA invece, è la scienza della classiHcazione. Quindi non riguarda solo l’atto di classiNcare,

ma anche i criteri, le regole e i metodi di classiNcazione. Fu ideata da Carl Linne ed è basata sul concetto di

SPECIE intesa come l’insieme degli individui che presentano un elevato numero di caratteristiche comuni e

di somiglianze a livello anatomico-morfologico e, più in generale, Nsiologico: tali caratteristiche differenziano

gli individui di una specie da quelli di tutte le altre. Gli esseri viventi vengono raggruppati in Taxa (categorie

gerarchiche) ordinate dalla più generale alla più speciNca: dominio, regno, phylum, classe, ordine, famiglia,

genere, specie (dominio più speciNco= organismi simili che possono incrociarsi e avere prole fertile). Di

solito, per nominare un organismo, si utilizzano due termini latini, corrispondenti alla specie e genere

GERARCHIA CLASSICA (TASSONOMIA)

Dal più ampio al più specifico:

1. Dominio il livello più alto (introdotto da Woese)

←

2. Regno

3. Phylum (o Divisione nelle piante)

4. Classe

5. Ordine

6. Famiglia

7. Genere

8. Specie

La nomenclatura binomiale è il sistema usato per dare un nome scientiNco a ogni specie, introdotto da

Carl Von Linné. È formato dal genere e dalla specie, ovvero essi danno il nome. Il primo è l’epiteto generico,

in corsivo maiuscolo e il secondo è l’epiteto speciNco, in corsivo minuscolo. Es. Homo (genere) sapiens

(specie) oppure Saccharomyces cereisiae. Gli altri livelli tassonomici sono da scrivere in maiuscolo e non in

corsivo.

Il ceppo è una classificazione con una sua definizione: un ceppo è l’insieme di tutte le cellule microbiche

teoreticamente originate da un’unica cellula progenitrice e quindi idealmente aventi un identico

patrimonio genetico. Un ceppo è un CLONE che però può ricevere mutazioni, quindi il ceppo può variare:

GENETIC DRIFT. Le mutazioni possono cambiare alcune caratteristiche del ceppo: metabolismo, resistenza

agli antibiotici, produzione di sostanze. Il microbiota in questo caso può perdere di potenza o diventare più

positivo.

Il DENDROGRAMMA = È un diagramma ad albero che mostra le relazioni tra organismi, ceppi o geni.

Serve a rappresentare somiglianze e differenze, soprattutto in tassonomia, filogenesi e microbiologia.

Le ramificazioni indicano grado di parentela: più due elementi sono vicini, più sono simili o strettamente

correlati evolutivamente.

IL MICROBIOTA UMANO

Il microbiota umano è formato da batteri, lieviti, muffe e molti virus. La specializzazione del microbiota varia

nelle diverse parti del corpo, hanno diverse specializzazioni. Il microbiota ha funzioni importanti:

DIGESTIONE E PRODUZIONE DI VITAMINE

• PROTEZIONE DA PATOGENI

• MODULAZIONE DEL SISTEMA IMMUNITARIO

•

Due importanti microbiologi: KOCH (il moo è la causa di una malattia) e METCHINKOFF (la teoria

dell’immortalità, la causa dell’invecchiamento è l’avvelenamento progressivo dell’organismo da parte di

prodotti di scarto tossici dai batteri intestinali e LA TEORIA DELLA LONGEIVITA, propone l‘uso batteri lattici

per contrastare gli effetti dell’invecchiamento e promuovere la longevità)

IL TRIANGOLO DELLA DIETA ovvero la relazione tra

dieta, essere umano e microbiota

intestinale.L’interazione del microbiota e l’essere

umano, una relazione bidirezionale.

• Dieta influenza microbiota

• Microbiota influenza salute dell’ospite

• Ospite influenza dieta e composizione del

microbiota l’apporto nutrizionale influisce

à

sull’effettivo stato di salute del microbiota che a

sua volta influenzerà la vita dell’ospite; il tutto può

essere eseplificato con un triangolo di

interazione..

LE FUNZIONI DEL MICROBIOTA:

METABOLISMO

- SISTEMA NERVOSO

- IMMUNIATRIO

- METABOLISMO DEI FARMACI

-

MICROBIOTA è il termine che dovrebbe essere usato per sostituire la parola "microflora" e deve essere

usato per deNnire l'insieme di tutte le cellule microbiche che colonizzano uno speciNco ecosistema

(QUALSIASI possibile ecosistema!). L’organismo nella sua individualità. È un organo metabolicamente attivo

del nostro corpo, con le funzioni che cambiano nel tempo. Insieme di cellule che colonizzano uno speciNco

ecosistema

Il MICROBIOMA è un intero habitat in cui risiedono i microrganismi, compreso il loro intero "teatro di

attività" (cioè i microrganismi, i loro genomi, le molecole che producono, le loro interazioni e l'ambiente

circostante). Comprende anche il microbiota ma anche il TEATRO DI ATTIVITA, tutto lo spettro di attività

LE DIVERSE INTERAZIONI CHE POSSONO AVERE GLI ORGANISMI

1. INTERAZIONI NEUTRE O POSITIVE

NEUTRALISMO= interazione tra specie senza benefici o danni

- COMMENSALISMO= interazione non obbligatoria tra due esseri viventi in cui uno approfitta del

- nutrimento o degli scarti dell'altro senza procurare danno o beneficio.

SINERGISMO = interazione non obbligatoria in cui entrambe le popolazioni traggono beneficio.

- Entrambe le popolazioni sono in grado di sopravvivere indipendentemente

MUTUALISMO= interazione obbligatoria tra due popolazioni che determina beneficio per entrambe

-

2. A DANNO

ANTAGONISMO: interazione tra specie nella quale una o ambedue le specie in relazione subiscono un

danno. Le principali relazioni antagonistiche sono antibiosi, parassitismo, predazione e competizione.

ANTIBIOSI: inibizione della crescita e della riproduzione di un microrganismo da parte di un

- altro.

PARASSITISMO: interazione fra due specie, generalmente di natura trofica, in cui una (il parassita)

- trae un vantaggio a spese dell’altra (l’ospite), creandogli un danno biologico.

PREDAZIONE: interazione in cui un organismo (predatore) usa come fonte di cibo un altro

- organismo solitamente di specie differente (preda).

COMPETIZIONE: interazione che si verifica quando due popolazioni stanno cercando la stessa

- risorsa di nutrienti o habitat (per es. competizione per nutrienti o per siti di adesione).

COLTUROMICA e METAGENOMICA

Studiare la flora intestinale è complesso a causa dell’elevata diversità microbica e dall’inaccessibilità di

molte aree dell’intestino.

LA COLTUROMICA: è il modo in cui identifichiamo il microrganismo, essi infatti possono essere isolati,

caratterizzati e studiati. Si concentra sulla coltivazione e sull’isolamento in laboratorio di moo. I vantaggi

sono la possibilità di ottenere informazioni dettagli su moo, incluso il comportamento in condizioni di coltura

controllate

ma c’è un problema: la maggior parte dei moo non può essere coltivata in laboratorio, meno dell’1% del

campione fecale viene coltivato quindi si usa la METAGENOMICA, non coltiva il moo, ma è la scienza che

studia il DNA estratto dai campioni senza coltivazione, distrugge il campione facendo fuoriuscire il

DNA e determinando il DNA tramite il sequenziamento. Però per studiare l’interazione dei moo, si potrà

studiare funzionalmente i geni. I vantaggi sono di avere una visione completa della diversità microbica,

inclusi i moo non coltivabili. Ma non fornisce informazioni sul comportamento e le caratteristiche specifiche

dei singoli moo

Caratteristica Culturomica Metagenomica

Basata su Coltivazione in laboratorio Sequenziamento del DNA diretto

Permette di Singole specie e comportamento Intera comunità microbica

studiare Molti microrganismi non

Limite Non dà info fenotipiche dettagliate

coltivabili Visione completa della diversità e funzioni

Punti di forza Dettagli su microrganismi isolati genetiche

MICROBIOTA TARGET APPROACH: si può studiare il microbiota a livello tassonomico, metagenomica,

metatrascriptomica (va a vedere i trascritti, quindi cosa in quel preciso momento è stato trascritto e la sua

funzione in quel preciso momento: ci dà un’idea di com’è in quel momento la nostra cellula); metaboloma

(metaboliti prodotti), viroma, machine learning (metodo statistico che ci permette di raggruppare e

discriminare determinati mo).

Gene 16s rRNA

Gene 16s rRNA: è il gene dei procarioti, altamente conservato, ma al suo interno contiene regioni da V1 a

V9 che sono ipervariabili, che ci danno informazione sul tipo di procariote che analizzo. Quando si usa il

sequenziamento si usano dei primer, sequenze complementari al DNA, da qui parte ampliNcazione e poi

sequenziamento. Ci serve la base conservata per potere utilizzare i primer, solo con regioni ipervariabili non

è possibile. Il sequenziamento con ampliNcazione può portarci a vedere le regioni ipervariabili e ad

identiNcare, e discriminare il tipo di batterio.

Per gli eucarioti esistono altri tipi di regioni, che funzionano allo stesso modo, le ITS, però il database non è

molto completo, quindi dà delle problematiche.

3) Spiega la differenza tra la definizione di «microbiota» e «microbioma» Microbiota: insieme di tutte

le cellule microbiche che colonizzano un ecosistema specifico (es. intestino, pelle).

Microbioma: include il microbiota + il loro habitat, genomi, metaboliti e interazioni rappresenta

→

l’intero “teatro di attività” microbico.

5) Spiega cosa è il 16S rRNA gene e a quale scopo viene utilizzato nello studio

del microbiota

Il 16S rRNA è un gene presente in tutti i batteri, che codiNca per una subunità del ribosoma.

Ha regioni conservate (per progettare primer universali) e regioni variabili (per distinguere specie). Uso

nello studio del microbiota:

Identificazione di batteri presenti in un campione

• Costruzione di dendrogrammi filogenetici

• Permette di studiare anche microrganismi non coltivabili in laboratorio

•

IL SEQUENZIAMENTO – LEZIONE 2

L’identiNcazione della sequenza del DNA permette di comprendere meglio la sua funzione biologica. Le

nuove tecnologie di sequenziamento hanno permesso di ridurre i costi di sequenziamento da milioni di

dollari a circa un migliaio del giorno d’oggi.

SEQUENZIAMENTO = Il termine sequenziamento si riferisce alla determinazione dell’ordine sequenziale

preciso delle subunità di una macromolecola.

- Genomica e Biologia Molecolare: Il sequenziamento del DNA è essenziale per comprendere la struttura e

la funzione dei genomi. Permette di identiNcare geni, regioni regolatorie e variazioni genetiche associate a

malattie e tratti ereditari.

- Medicina Personalizzata: Il sequenziamento del DNA contribuisce allo sviluppo della medicina

personalizzata, consentendo la progettazione di terapie e trattamenti mirati in base alle caratteristiche

genetiche di un individuo.

- Ricerca sul Cancro: Nel contesto della ricerca sul cancro, il sequenziamento del DNA aiuta a identiNcare

mutazioni genetiche che possono essere alla base della formazione e dello sviluppo del cancro, fornendo

così informazioni cruciali per il trattamento.

- Agricoltura e Biotecnologia: Nel campo agricolo, il sequenziamento del DNA è utilizzato per migliorare le

colture, selezionare caratteristiche desiderate e sviluppare organismi geneticamente modiNcati (OGM) con

caratteristiche agronomiche ottimizzate.

- Ecologia e Conservazione: Il sequenziamento del DNA è utilizzato per studiare la diversità genetica nelle

popolazioni animali e vegetali, contribuendo così alla conservazione della biodiversità e alla gestione

sostenibile degli ecosistemi.

- Microbiologia: Nella microbiologia, il sequenziamento del DNA è fondamentale per identiNcare e

caratterizzare microrganismi, comprendere le dinamiche delle comunità microbiche e studiare la resistenza

agli antibiotici.

Sono diverse le tecniche di sequenziamento:

SANGER = sequenzia 700-800 bp

- NEXT GENERATION SEQUENCING:

- CLONALLY AMPLIFIED DNAs: ILLUMINA, PYROSEQUENCING, ION TORRENT

o SINGLE MOLECULE DNA: PACBIO, NANOPORE capacità di riuscire a sequenziare 10-30

à

o kb

Costi del sequenziamento: ad oggi per sequenziare un genoma umano un giorno di lavoro e circa 1000

dollari; quindici anni fa ci sarebbero voluti otto anni e oltre 100 milioni di dollari. Con i nuovi metodi di

sequenziamento si sono ridotti i costi energetici del sequenziamento.

SEQUENZIAMENTO DI PRIMA GENERAZIONE: SANGER

Prevede di creare una popolazione di frammenti di diversa lunghezza del DNA da sequenziare. Questi

frammenti sono poi separati in base al peso, con un procedimento chiamato elettroforesi, e la sequenza è

ricostruita sapendo che ciascun segmento si interrompe dove si trova un nucleotide noto.

Per sequenziare è necessaria una MISCELA DI SEQUENZIAMENTO:

PRIMER= una breve sequenza di DNA che da inzio alla sintesi

- DNA STAMPO = il filamento da leggere

- DNA POLIMERASI= enzima che costruisce il nuovo filamento

- NUCLEOTIDI= con l’OH AL 3’

- NUCLEOTIDI TERMINATOR = non permette, per la mancanza di un gruppo ossidrile in posizione 3’,

- che ci sia l’attacco con la base successiva. Bloccano la sintesi non appena sono incorporato. Ha

anche un FLUOROCROMO attaccato che assorbe fotoni di una certa lunghezza d’onda. A seconda

del colore sapremo il nucleotide marcato

COME FUNZIONA?

Tutti i componenti della miscela sono in una provetta.

Il primer è il primo ad annelarsi (la prima parte di DNA dove il primer si attacca è conosciuta, grazie a zone

conservate). Si attacca la polimerasi che permette di aggiungere i nucleotidi, sequenzierà la sequenza fino

a quando non viene attaccato un nucleotidi terminator marcato.

IL TEOREMA DEI GRANDI NUMERI= in modo randomico avremo per ogni posizione un nucleotide

terminatore

Una volta ottenuti i frammenti, questi vengono separati in base alla dimensione tramite elettroforesi

capillare. I frammenti più piccoli sono i primi ad uscire, quelli più grandi gli ultimi. Quando escono passano

davanti a un laser che eccita il marcatore fluorescente, ognuno rilascia un colore.

L’ELETTROFEROGRAMMA sono dei picchi colorati, il primo picco è la prima posizione con un colore. In

questo modo troveremo la sequenza e andremo ad analizzarla al database grazie al DETECTOR.

NEXT GENERATION SEQUENCING: ILLUMINA

Illumina riesce a parallelizzare il processo di sequenziamento producendo un grande numero di sequenze

contemporaneamente; per discriminare le basi.

Uso di un supporto solido al