Biotecnologie delle cellule staminali

Biotecnologie cellulari pt.2

Luca Mennella

Date: September 12, 2024

University of Trento

Biomolecular Science and Technology

Via Sommarive 9, 38123 Povo (TN), Italy

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Glicosilazione delle proteine nelle cellule eucariotiche

Glicosilazione delle proteine

Molte proteine richiedono modifiche post-traduzionali per assicurare la piena attività biologica che è essenziale per il loro utilizzo come biofarmaci efficaci. Poiché le cellule eucariotiche hanno la capacità metabolica per questo tipo di modifiche, sono diventate le cellule ospiti utilizzate nei processi biofarmaceutici. La glicosilazione delle proteine si verifica quando un gruppo zuccherino (oligosaccaride) è legato in modo covalente a una proteina. Molte proteine terapeutiche ricombinanti richiedono glicosilazione per l'efficacia clinica. Cambiamenti incontrollati nel modello di glicosilazione delle proteine sono di grande preoccupazione da un punto di vista industriale e regolatorio. L'alterazione dell'attacco degli oligosaccaridi può modificare la funzione biologica della proteina. La FDA autorizza il modello di glicosilazione come parte della specifica del farmaco. È di fondamentale importanza ingegnerizzare linee cellulari in grado di esprimere pattern di glicosilazione riproducibili. Finché il produttore opera all'interno di un insieme ristretto di condizioni di processo, il farmaco avrà probabilmente la stessa impronta digitale da lotto a lotto.

Si tratta di una modifica post-traduzionale che consiste nell’addizione di polimeri di zuccheri alle proteine. È una modifica che prevede il pathway secretorio e tipicamente sono proteine secrete o di membrana. Quindi, l’RNA deve essere trasportata nell’ER e la proteina sintetizzata nel lumen dell’ER. Vi sono due diverse modificazioni a seconda che si aggiungono zuccheri alle serine o asparagine (N-linked o O-linked). La cellula ha degli zuccheri che marcano la proteina come proteina endogena. Le proteine che hanno zuccheri non endogeni sono marcate come esterne.

La glicosilazione comporta dei cambiamenti: l’aggiunta di molecole altamente idrofile influisce sulla solubilità della proteina ma anche sulla sua struttura terziaria siccome i polimeri hanno un certo ingombro. Si formano una serie di interazioni tra la catena zuccherina e quella amminoacidica che modificano la stabilità e il folding. Quindi, hanno anche un ruolo nel guidare l’attività. Se si vuole produrre una proteina negli eucarioti, bisogna pensare che magari debba essere glicosilata e di conseguenza bisogna guidare anche questo processo. Si tratta di un problema perché la glicosilazione dipende molto non solo dallo stampo (la proteina) ma anche da quello che la cellula ha a disposizione dal punto di vista dei metaboliti. Cambiamenti anche minimi del pattern di glicosilazione guidano l’attività, l’FDA chiede sempre come viene guidato il pathway di glicosilazione e se è ripetibile o meno.

L’addizione di oligosaccaridi è variabile

L'attacco di un oligosaccaride non è guidato esclusivamente dal modello.

• Macroeterogeneità: se un sito specifico è o non è glicosilato
• Microeterogeneità: diversi oligosaccaridi possono legarsi nello stesso sito

Il grado di eterogeneità dipende dalla posizione di attacco nella proteina, dalla conformazione proteica, dallo stato fisiologico della cellula, dell'organismo, del vettore di espressione e dall'ambiente di coltura. Il pattern di glicosilazione induce cambiamenti fisico-chimici e strutturali alterando, ad esempio, il riconoscimento delle proteine da parte dei recettori:

• Solubilità, dimensioni, viscosità, carica elettrica, massa, oligomerizzazione
• L'acido sialico, uno zucchero acido, aumenta le dimensioni e la massa e cambia carica e solubilità
• Comunemente le glicoproteine diventano più rigide a causa del legame idrogeno tra gli zuccheri
• Aiuta nel ripiegamento delle proteine, aumenta la stabilità termica

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Può succedere che il grado di glicosilazione aggiunto sia diverso. Se la cellula non ha a disposizione la serina o altri tipi di amminoacidi che non può produrre, la cellula muore. Nel caso degli zuccheri, questo non vale: la proteina è prodotta lo stesso e la cellula inserisce altri tipi di zuccheri che la cellula ha a disposizione. Si distinguono due tipi di eterogeneità nella produzione:

• Macro: dove viene aggiunta la catena oligosaccaridica
• Micro: cosa viene aggiunta nella catena oligosaccaridica.

La glicosilazione porta ad un incremento nel folding, nella stabilità strutturale, ma porta anche ad una stabilità di emivita quando la proteina si trova nell’organismo. Un farmaco ha una sua attività terapeutica grazie alla somma di due fattori: la sua attività biologica vera e propria, ad esempio l’interazione con il target, e la sua emivita nell’organismo, ovvero quanto tempo rimane all’interno dell’organismo. Questi due parametri sono detti farmacodinamica e farmacogenetica. La glicosilazione delle proteine influenza sia l’attività biologica che il tasso di clearance. Cambia anche la clearance perché alcuni tipi di glicosilazione determinano un’eliminazione rapida della proteina da parte dell’organismo.

Attività terapeutica vs attività biologica

L'attività terapeutica è diversa dall'attività biologica. L'attività terapeutica è la somma dell'attività biologica (farmacodinamica) e del tasso di eliminazione (farmacocinetica) dall'organismo. Una proteina con un'attività biologica estremamente elevata ma con una rapida clearance non ha un impatto terapeutico. L'efficacia biofarmaceutica (EPO, tPA o Fattore VIII) è altamente correlata con il pattern di glicosilazione.

EPO: la desialilazione dell'eritropoietina ha migliorato la sua attività in vitro aumentando la sua affinità per il recettore, ma ha diminuito la sua attività in vivo, presumibilmente diminuendo la sua durata in circolazione. L'EPO aumenta l'efficacia se il contenuto di acido sialico è più alto. Il fattore di crescita EPO, se manca di alcuni zuccheri, in particolare di acidi sialici, è molto affine per il recettore. Se si utilizza la proteina senza questi zuccheri, essa viene subito portata a degradazione. Si cerca perciò di modificare la produzione dell’eritropoietina per favorire questa glicosilazione.

Considerazioni immunogeniche

Contribuisce alle proprietà antigeniche di una proteina:

• A causa dell'unità di carboidrati
• Modifica del peptide (la proteina che espone una sequenza antigenica dopo cambiamenti conformazionali)

Esempio: il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) attiva il sistema fagocitario e viene utilizzato clinicamente per prevenire alcuni tipi di infezione dopo la chemioterapia e la radioterapia. Quando prodotto nel lievito ha una bassa glicosilazione, i pazienti che hanno ricevuto questo prodotto hanno sviluppato anticorpi contro l'hGM-CSF nativo perché il prodotto di lievito esponeva una porzione della proteina nativa normalmente protetta.

Alcune glicosilazioni sono immunogeniche perché alcuni zuccheri non sono riconosciuti dal nostro organismo e scatenano una risposta immunitaria. Oppure può succedere che la proteina venga cambiata e si espongano delle regioni che normalmente sono nascoste e vengono riconosciute come non-self.

Ci sono due tipi di oligosaccaridi legati alle proteine

Vi sono due tipi di glicosilazioni:

• Oligosaccaridi N-linked: sono legati all’asparagine attraverso il gruppo R da un legame N-glicosidico
• Oligosaccaridi O-linked: sono legati alla serina o alla treonina da un legame O-glicosidico

Seguono due vie biosintetiche diverse. 3 Zuccheri più comuni trovati sulle proteine

Sono 3 i tipi di zuccheri più usati:

• Neutri: non hanno gruppi funzionali
• Amminici: hanno ammine associate e quindi cambiano la pKa dello zucchero.
• Acidi: è solo l’acido sialico che ha associato un gruppo acido.

O-glicosilazione

Non esiste un consenso, anche se la glicosilazione si verifica spesso in una regione della proteina che contiene un'alta percentuale di serina, treonina e prolina. Il primo zucchero è solitamente una N-acetilgalattosamina, legata a Thr o Ser tramite una transferasi dedicata. Più comune nelle proteine secrete e legate alla membrana. Ci sono diverse strutture di base degli zuccheri (modulo iniziale) su cui da uno a 20 zuccheri vengono aggiunti. Modifica post-piegatura: l'O-glicano viene aggiunto post-traduzionalmente alla proteina completamente foldata.

I zuccheri O-linked sono piuttosto variabili e quindi è più difficile controllarne la sintesi. Fondamentale non è fatta molta attenzione su come modificarli, anche perché non esiste la presenza di un consensus preciso. Questo tipo di glicosilazione tendenzialmente riguarda proteine di membrana o della matrice extracellulare. In questo caso lo zucchero O-linked ha la funzione di allargare il volume della proteina, di aumentarne la rigidità e fornire supporto per la matrice extracellulare. Questo tipo di modifica è aggiunta post-traduzionalmente: la proteina è tradotta e poi gli viene aggiunto lo zucchero.

N-glicosilazione

Consenso: Asn-X-Ser/Thr, X può essere qualsiasi amminoacido tranne la prolina. Questo consenso è necessario ma non sufficiente. Gli Asn N-ter hanno maggiori probabilità di essere glicosilati mentre gli Asn nascosti sono meno probabili. Gli oligosaccaridi legati agli N derivano da un comune complesso 14-zucchero-lipidi. La catena zuccherina centrale è ampiamente modificata dall'aggiunta o dall'eliminazione di zuccheri in seguito all'attaccamento alla proteina. Cinque sono conservati dopo la modifica: Man3GlcNAc2 (tre mannosi e 2 N-acetilglucosamine). Dopo la regione conservata (5x zuccheri), ci sono tre possibili configurazioni:

• Complesso: Polisaccaridi che si diramano dagli zuccheri terminali (antenne) terminando con acidi sialici
• Mannosio: Mannosi
• Ibrido: un mannosio e un complesso

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In questo caso si ha un consenso: Asp-X-Ser-Thr. Si ha un percorso preciso di step biochimici che determina la glicosilazione. All’asparagine sono associati 5 zuccheri: 2 N-acetil-glucosamine e 3 mannosi che hanno una struttura a Y. Questa viene detta struttura core, che però non quella finale ma di riferimento. Su questa struttura sono aggiunti altri zuccheri che formano le cosiddette antenne. Si distinguono le antenne ad alto contenuto di mannosio e le antenne di tipo complesso in cui sono presenti diversi tipi di zuccheri. È presente anche un tipo intermedio con una situazione ibrida.

Per passare dalla struttura a core a quella ad antenne, nel mezzo è presente un processo biochimico che passa per l’aggiunta di uno zucchero a 14 elementi, che poi viene eliminato e poi aggiunta l’antenna.

Possibili antenne

Per ogni mannosio si hanno tendenzialmente 2-3 antenne.

Biosintesi degli N-oligosaccaridi

Tre passaggi:

• Ciclo del dolicolo e oligotrasferimento alla proteina
• Reazione di trimming (rimozione di glucosio e mannosio)
• Reazione di ramificazione (costruzione di antenne)

Ciclo dolicolo

Il dolicolo è un alcol derivato dall'isoprene che termina con un gruppo alcolico. Il ciclo dolicolo prevede un alcol che è presente sulla membrana dell’ER ed espone sul lato citoplasmatico il fosfato che può essere funzionalizzato con degli zuccheri fino ad avere 2 glucosamine e 5 mannosi. Quando raggiunge questa conformazione si ha un flip dal lato citoplasmatico nel lumen. Qui vengono aggiunti altri glucosi.

Biosintesi del core oligosaccaride

Il dolichil fosfato è incorporato nella membrana del reticolo endoplasmatico (ER). Sulla faccia citosolica dell'ER dove gli zuccheri vengono aggiunti in sequenza al dolichil fosfato. Quando 2 GlcNAc e 5 mannosio vengono aggiunti al dolichil fosfato, l'oligosaccaride si capovolge nel lume del reticolo endoplasmatico. Dove vengono aggiunti altri sette zuccheri (4 mannosio e 3 glucosio, per un totale di 14 zuccheri). Il completo (Glc)3 (Man)9 (GlcNAc)2-PP-dol è necessario per la reazione successiva. L'oligosaccariltransferasi (OligoST) trasferisce l'intero oligosaccaride a un ASN di un polipeptide nascente. Glicosilazione co-traduzionale: l'oligo ST (oligosaccariltransferasi) lega l'oligosaccaride mentre la proteina viene sintetizzata.

Questo serve per aiutare la proteina nel suo folding. La proteina viene sintetizzata all’interno del lumen. Durante la sintesi espone delle asparagine e se nel lumen è presente il dolicolo con attaccati i 14 zuccheri, una oligosaccaril-transferasi catalizza il trasferimento di questa catena oligosaccaridica sull’asparagine dal dolicolo. Non tutte le asparagine vengono glicosilate, anche perché man mano che viene prodotta la proteina, questa si riarrangia; quindi, alcune asparagine possono non essere disponibili. Questa addizione co-traduzionale determina il folding e la scelta delle asparagine da glicosilare.

Macroeterogeneità

Macroeterogeneità: se un sito specifico è o non è glicosilato. L'occupazione di un sequone avviene co-traslazionalmente nell'ER e comporta il trasferimento di una struttura oligosaccaridica consenso (Glc3Man9GlcNAc2) da un donatore di pirofosfato legato al dolicolo alla catena laterale Asn di un sequone disponibile. Solo il 65% circa di tutti i sequoni è occupato. La reazione di trasferimento dell'oligosaccarile sembra dipendere da vari fattori cellulari, tra cui:

• Il tasso di traduzione delle proteine
• La disponibilità del donatore di oligosaccarile
• L'attività dell'enzima
• Formazione del legame disolfuro

I sequoni inaccessibili nella forma ripiegata della proteina sono occupati anche perché la glicosilazione delle proteine precede e guida il ripiegamento. La frequenza dei sequoni non glicosilati aumenta verso il C-terminale. La distanza critica è di 60 residui di amminoacidi dal C-terminale quando si verifica una ridotta occupazione di glicani. Corrisponde alla distanza tra il sito P del ribosoma e il sito attivo della OST (oligosaccariltransferasi). È stato ipotizzato che la catena proteica non sia disponibile per l'attacco di N-glicani una volta rilasciata dal ribosoma.

Questo determina la macroeterogeneicità: non tutte le asparagine vengono glicosilate. La glicosilazione dipende dalla presenza dell’enzima transferasi, degli enzimi che regolano il folding, dall’elemento di protezione, poiché una parte della proteina rimane coperta dal ribosoma e alcune asparagine possono non rimanere disponibili per il trasferimento.

Trimming reaction (rimozione di glucosio e mannosio)

Si inizia con la rimozione dei 3 glucosio e dei mannosi terminali. Si verifica nel pronto soccorso/Golgi. La rifilatura viene eseguita nel:

1. Reticolo endoplasmatico:
   • Glucosidasi (GI, GII, GIII)
   • Mannoidasi I
   • Nelle cellule di mammifero le strutture dei glicani ad alto contenuto di mannosio sono prodotte come intermedi nella formazione di glicani complessi.
2. Trasporto a Golgi
   • Mannosidasi II e III, eliminazione delle antenne del mannosio
   • La struttura centrale è ottenuta

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La rimozione dei glucosi nel reticolo endoplasmatico è fondamentale per il corretto ripiegamento della proteina. Questo processo sequenziale di trimming nell'ER avverrà in modo efficiente solo se la proteina assume un modello di ripiegamento appropriato e quindi il processo è stato pensato come un meccanismo di controllo della qualità necessario per la formazione della struttura terziaria della proteina.

È una riduzione degli zuccheri che sono stati aggiunti: a livello dell’ER si hanno dei cicli di controllo del folding proteico e dipendono dalla presenza di glucosi terminali. Il ciclo riconosce il glucosio terminale e se la proteina è correttamente foldata essa prosegue il suo percorso passando nel Golgi. In questo passaggio si ha rimozione dei glucosi e dei mannosi. Questo è un percorso continuo progressivo dal reticolo al Golgi che avviene solo se a livello dell’ER si è osservato un corretto folding. Se non è correttamente foldata, la proteina viene spostata sul lato citoplasmatico dell’ER e degradata.

Branching reaction (costruzione delle antenne)

Si trova nel Golgi. Estremamente complesso, poiché la biosintesi può derivare da oligosaccaridi bi-antenna fino a oligosaccaridi tetra-antenne. GlcNAc-TI (transferasi I) è l'enzima chiave per la conversione da tipo mannosio a N-oligosaccaridi di tipo ibrido o complesso. Il secondo zucchero aggiunto è il galattosio. Importante per l'efficacia di molte proteine glicosilate terapeutiche (EPO, Fattore VIII) è la sialilazione. La sialiltransferasi catalizza la sialilazione all'estremità terminale. L'acido sialico più comune è il NeuAc (acido N-acetilneuraminico). Tutte le transferasi utilizzano zuccheri legati ai nucleotidi (cioè UDP-GlcNAc) o zuccheri legati al dolicolo (OligoST).

La proteina è stata modificata in modo tale che siano stati aggiunti questi 14 zuccheri; l’oligosaccaride è stato ridotto fino al mantenimento del core. Nel Golgi incontra altri tipi di transferasi che promuovono la sintesi delle antenne, ovvero gli ultimi zuccheri attaccati alla struttura core. Tendenzialmente si ha una sequenza ripetuta: aggiunta di una N-acetilglucosamina, galattosio e poi acido sialico.

Trimming e branching reactions degli N-oligosaccaridi

Punti chiave della ramificazione:

• Mannosidasi del Golgi e de