Biotecnologie cellulari

Biotecnologie cellulari

Luca Mennella

Date: September 12, 2024

University of Trento

Biomolecular Science and Technology

Via Sommarive 9, 38123 Povo (TN), Italy

Capitolo 1: mezzi di coltura

Condizioni delle colture per cellule animali

Per la crescita in vitro, le cellule animali richiedono un apporto di nutrienti equivalente a quello che ricevono in vivo. I primi tentativi furono fatti per usare solo fluidi biologici come plasma o siero. Il terreno di coltura fornisce il pH e l’osmolarità corretti per la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule, così come elementi chimici essenziali. Alcune di queste sostanze possono essere apportate con un terreno di coltura consistente in molecole a basso peso molecolare, conosciuto come matrice basale.

Differenti tipi di terreni hanno diversi scopi per favorire:

• La proliferazione
• Il mantenimento
• La differenziazione

I terreni mimano tutte le condizioni che si trovano nel tessuto di provenienza della cellula. In primo luogo, ci si focalizza sui fattori di crescita.

Si parte dall’animale, il cui tessuto viene disgregato e messo in piastre. I nutrienti delle cellule provengono dal sangue negli organismi superiori; perciò, come risorsa primaria viene usato plasma o siero perché è ricchissimo di nutrienti. Però, vanno fatte delle correzioni al siero e vengono aggiunti sali, nutrienti come il glucosio per creare un terreno completo che permette la crescita delle cellule nella piastra e altri elementi. Dovremmo essere in grado di produrre un terreno che mantenga le cellule in uno stato ben preciso in base alla natura del nostro esperimento. Lo scopo è coltivare le cellule per dire alle cellule dove andare e cosa fare.

Condizioni fisico-chimiche

Le condizioni fisico-chimiche che consentono la crescita delle cellule sono:

• Temperatura (intorno a 35-37°)
• Ossigeno dissolto
• Sistema buffer (NaHCO₃)
• pH (intorno a 7.2-7.4)

Temperatura

Le cellule in coltura richiedono un controllo della temperatura severo almeno quanto negli organismi viventi. Sebbene le cellule di mammifero crescano normalmente a 37°C, per certi tipi di cellule l’incubatore deve essere in grado di regolare precisamente anche a 30° C o 34° C. La temperatura ottimale dipende dall’organismo da cui le cellule derivano.

Le cellule di mammifero tollerano anche significative cadute di temperatura (sopravvivono per diversi giorni a 4° C). Però, anche aumenti di soli 2° C portano alla morte nel giro di poche ore. Anche il pH cambia dovuto alla diversa solubilità della CO₂ a varie temperature.

Un incubatore deve anche mantenere umidità oltre alla temperatura e ciò viene svolto inserendo una vaschetta d’acqua. Il tappo delle fiasche è ventilato e permette scambi di vapore. L’incubatore ha anche delle valvole che permettono iniezione di gas, in particolar modo di CO₂, questo perché permette di mantenere il sistema tampone del terreno che è a base di carbonato.

Ossigeno

Il comportamento delle colture cambia in base alla presenza di ossigeno. Esso è dissolto (trasportatori come emoglobina sono raramente usati). La profondità del terreno di coltura influenza sulla velocità di diffusione del gas. La profondità del liquido in colture statiche influenza la diffusione dell’ossigeno, quindi, è preferibile mantenere una bassa profondità. L’areazione di colture statiche richiede un volume vuoto d’aria circa 10 volte maggiore di quello del terreno di coltura. Troppo ossigeno porta alla formazione di radicali liberi.

L’ossigeno è importante perché stimola la respirazione cellulare e si va in glicolisi. Il problema è che non si ha il trasportatore dell’ossigeno, l’emoglobina, perciò ci si deve affidare all’ossigeno sciolto nel liquido che entra e permea le cellule. Per diffusione l’ossigeno dell’aria a contatto con il liquido entra nelle cellule, le quali sono adese sulla piastra. Più è alto il gradiente del terreno liquido, meno ossigeno arriva alle cellule.

Queste sono condizioni molto grezze e le cellule hanno capacità di adattamento molto elevate. La presenza di ossigeno non vuol dire che le cellule lavorano per forza con la respirazione cellulare. Anche in presenza di ossigeno lavorano con la glicolisi, in base alle condizioni del terreno.

La quantità di ossigeno disciolto è il primo fattore limitante in colture ad alta densità. Nelle colture sotto mescolamento, il trasferimento di ossigeno dipende dalla velocità di mescolamento e dalla geometria del mescolatore. L’agitazione può portare a danneggiare le cellule per via del contatto tra le cellule, del flusso di bolle e della presenza di schiuma.

Bioreattore

Il bioreattore è un grosso recipiente che mantiene la temperatura idonea attraverso lo scorrimento di acqua e al suo interno si trovano delle pale che mantengono in agitazione il terreno di coltura per rendere la distribuzione omogenea delle sostanze.

• Bioreattore: può essere descritto come un contenitore che ha disposizione di colture cellulari in condizioni sterili e controllo delle condizioni dell’ambiente (pH, temperature, ossigeno dissolto, ecc.). Può essere usato per la coltivazione di microbi, piante o cellule animali.
• Agitatore: questo facilita il mescolamento dei contenuti nel reattore che mantiene le cellule nella perfetta condizione omogenea per un migliore trasporto di nutrienti e ossigeno per un adeguato metabolismo della cellula che porta ai prodotti desiderati.
• Spargitore: in coltivazioni aerobiche, lo scopo dello spargitore è fornire ossigeno per la crescita delle cellule. Il flusso di aria compressa attraverso lo spargitore non solo fornisce ossigeno adeguato alla crescita delle cellule, ma aiuta anche a mischiare i contenuti del reattore riducendo il potere consumato per raggiungere un particolare livello di omogeneità della coltura.
• Jacket: fornisce l’area anulare per la circolazione di acqua a temperatura costante che mantiene la temperatura del bioreattore ad un valore costante.
• Misuratore di temperatura e controllo: il misuratore di temperatura del bioreattore è composto da una termocoppia che essenzialmente manda il segnale al controllore della temperatura.
• Misuratore di pH e controllo: il misuratore di pH nel bioreattore è composto da una sonda di pH autoclavabile.
• Controllore di ossigeno dissolto: l’ossigeno dissolto nel bioreattore è misurato da una sonda che genera potenziale corrispondente all’ossigeno dissolto diffuso nella sonda.
• Controllo della schiuma: il brodo di fermentazione contiene un numero di composti organici e il brodo è agitato vigorosamente per mantenere le cellule sospese e assicura un trasferimento efficiente di nutrimento da nutrienti dissolti e ossigeno. Questo porta ad un aumento di schiuma. È essenziale che il controllo della schiuma sia fatto il prima possibile.

I bioreattori servono per far crescere in maniera elevata grandi quantità di cellule che devono produrre sostanze. Dopo aver raccolto la massa di cellule si procede con lisi e colonna cromatografica per isolamento del prodotto. I bioreattori, quindi, servono per uno scopo produttivo.

Le cellule che sono contenute nel bioreattore devono essere immortalizzate e non devono aver bisogno di fattori di adesione per la crescita: devono essere in grado di vivere in sospensione, come le cellule del sangue, ma quest’ultime sono difficili da immortalizzare. Per processi industriali si usano cellule di origine epiteliale che sono state rese idonee a vivere in sospensione. Si possono usare anche delle microbiglie porose dove le nostre cellule, che invece vivono in adesione, vanno a colonizzare la superficie interna ed esterna della biglia, la quale rimane in sospensione.

Terreni di coltura per cellule animali

Il terreno di coltura di tipo completo è un terreno composto da due parti:

• Mezzo basale, il quale è composto da: soluzione salina bilanciata (BSS), in un corretto range di osmolarità e pH. Essa comprende un sistema tampone; nutrienti, tra cui glucosio, amminoacidi, acidi nucleici, lipidi, sali minerali e vitamine;
• Supplementi, che forniscono altri bisogni cellulari permettendo la crescita cellulare nel mezzo basale (siero, fattori di crescita, ormoni peptidici) e antibiotici. Generalmente, sono aggiunti prima di essere usati essendo instabili. In generale i supplementi comprendono tutto ciò che non fa parte dei nutrienti. Il siero è il supplemento più complesso e contiene tra le altre cose l’albumina.

L’indicatore pH non è compreso nella soluzione salina.

Mezzo basale

I mezzi frequentemente usati per la coltivazione di linee continue di cellule di mammifero sono:

• MEM è stato sviluppato dal Basal Medium of Eagle (BME) incrementando il range e la concentrazione dei componenti. Per molti anni il MEM di Eagle ha avuto il maggior uso tra tutti i mezzi.
• DMEM è stato sviluppato per fibroblasti di topo per studi di trasformazione e propagazione di virus. Contiene il doppio della concentrazione di amminoacidi del MEM, 4 volte la concentrazione di vitamine e 2 volte la concentrazione di HCO₃ e CO₂ per ottenere un migliore effetto di buffering. Si usa per cellule con una crescita robusta e un metabolismo elevato.
• RMPI 1640 è stato sviluppato per cellule linfoidi. RMPI 1640 ha un ampio range di uso, spesso anche per cellule che crescono in adesione, nonostante sia designato per sospensione e culture prive di calcio.
• Ham’s F12 medium, ricco di amminoacidi, è stato sviluppato per clonare cellule CHO in mezzi a basso contenuto di siero. È largamente usato, in particolare per saggi clonogenici e culture primarie, spesso combinato con DMEM. Più che un terreno viene usato come additivo, viene mescolato insieme ad altri terreni, come il DMEM, per aumentare la quantità di nutrienti nel terreno di coltura. È un terreno ricco di amminoacidi.

Acqua

Le cellule animali sono estremamente sensibili alla qualità dell’acqua, siccome può essere la sorgente di contaminazione che possono influire sulla crescita cellulare. Potenziali contaminanti:

• Composti inorganici (metalli pesanti, ferro, calcio e cloro)
• Composti organici (detergenti)
• Contaminanti relativi a microbi (endotossine e pirogeni)

Sistemi di purificazione dell’acqua:

• Sistemi di multipla distillazione
• Attrezzatura combinata a deionizzazione, microfiltrazione e osmosi inversa

Soluzione salina bilanciata per cellule animali

Le soluzioni saline bilanciate sono importanti perché sono quelle soluzioni che usiamo per far passare le cellule da una situazione all’altra: è una soluzione che mantiene l’osmolarità, non fornisce i nutrienti necessari per la crescita della cellula ma che non servono perché hanno un utilizzo limitato nel tempo. Su questi terreni si possono aggiungere gli altri elementi necessari come gli amminoacidi.

I sali maggiormente aggiunti ai terreni di colture sono Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Cl^-, SO₄^2-, PO₄^3- e HCO₃^-. Servono per il mantenimento dell’equilibrio ionico e della pressione osmotica o come cofattori enzimatici. Per colture in sospensione, la concentrazione di calcio e magnesio dovrebbe essere mantenuta bassa per prevenire l’aggregazione e l’adesione delle cellule.

Ferro, manganese, selenio, vanadio, zinco, rame e molibdeno sono di solito aggiunti al terreno di colture, ma a concentrazioni ridotte e soltanto se il mezzo non è integrato con siero animale.

La soluzione di EARLE e la soluzione di HANS differiscono per la quantità di bicarbonato contenuta.

• Soluzione di EARLE: alto bicarbonato, 5% CO₂;
• Soluzione di HANK: basso bicarbonato, CO₂ atmosferica.

BSS sono usate come diluente per concentrazioni di amminoacidi e vitamine per completare il mezzo e come mezzo isotonico per dissezione e brevi incubazioni.

La presenza del calcio o meno determina se usare le cellule in sospensione o no. La sua assenza favorisce la coltura in sospensione. Il glucosio è presente anche in piccola quantità nella BSS.

Altra soluzione molto famosa è il PBS, ovvero il tampone fosfato, che si usa spesso anche in biochimica perché relativamente inerte.

Nel mezzo basale non è presente il siero, ma è composto solo da soluzione salina e nutrienti. Al mezzo basale aggiungo il secondo componente che sono i componenti più complessi, i supplementi, e a quel punto diventa un terreno completo.

Sistema tampone

Il sistema tampone serve per evitare variazioni improvvise di pH, che normalmente avvengono in seguito ad attività metaboliche delle cellule che acidificano il terreno. Se il pH scende sotto a 7 le cellule non proliferano e quindi si butta la coltura.

Bicarbonato-anidride carbonica

Il sistema consiste in sodio bicarbonato (o potassio), presente come nutriente per il mezzo, e anidride carbonica presente nell’atmosfera dell’incubatore.

• pH basico del mezzo: è corretto dalla ionizzazione di acido carbonico derivato dalla dissoluzione di CO₂ in acqua;
• pH acido del mezzo: è corretto dalla formazione di bicarbonato di sodio (che deriva dall’eccesso di carbonato) aggiunto al mezzo di coltura.

L’equilibrio tra carbonato e bicarbonato di sodio è mantenuto nel mezzo di coltura grazie alla presenza di CO₂. Il pH è mantenuto tra 7 e 7.4 nel terreno di coltura.

Altri agenti tamponanti

• HBSS, EBSS e D-PBS sono basati su proprietà tamponanti del fosfato (relativamente debole), che è alla sua massima efficienza a pH fisiologico.
• Tris HCl è più efficace, ma la cellula richiede un periodo di adattamento.
• HEPES (10-20 mM) è attualmente l’agente tamponante più efficace nel range di pH 7.2-7.8.
• Tricina lavora tra pH 7.4-8.0.
• L’agente tamponante più importante è HEPES integrato con il sistema CO₂/HCO₃^-. Però il sistema CO₂/HCO₃^- è essenziale.

Il mezzo con alta concentrazione di piruvato ha meno bisogno di CO₂ esterna per mantenere il pH.

Equilibrio bicarbonato va di pari passo con la concentrazione di CO₂ nella fase gassosa. Il potere tamponante deve essere forte quando le cellule sono molto proliferanti.

Indicatore acido-base

In molti casi, un colorante pH sensibile può essere incorporato nel mezzo di crescita per un controllo visivo del livello di pH durante la crescita. Un esempio di indicatore acido-base è il rosso fenolo: è una molecola biologica la cui presenza influisce su alcuni meccanismi molecolari come la via segnaletica degli estrogeni che viene incrementata. Perciò negli studi sull’azione di ormoni deve essere rimosso e si utilizza un terreno bianco.

Nutrienti

Amminoacidi

Gli amminoacidi essenziali sono richiesti dalle cellule in coltura, insieme a cisteina, arginina, glutammina e tirosina. Circa 0.1-1 mM di ogni amminoacido è incluso nel mezzo di coltura, inclusi sia gli amminoacidi essenziali che quelli non essenziali. Un basso livello di amminoacidi causa l’arresto della crescita cellulare.

La glutammina agisce come sorgente di carbone, azoto ed energia ed è normalmente aggiunta al mezzo di coltura ad alte concentrazioni, in un range di 1-5 mM. Tale concentrazione elevata è dovuta al fatto che si degrada facilmente e al fatto che la glutammina è importante dal punto di vista metabolico; infatti, viene usata per la sintesi di a-chetoglutarato e quindi può essere usata come substrato energetico per riattivare il ciclo di Krebs. La glutammina è suscettibile a degradazione e dovrebbe essere rimpiazzata periodicamente. La glutammina è predisposta per essere ubiquitinata e quindi degradata. Essa genera ammonio che è un inibitore della crescita cellulare quando accumulato in grandi quantità. Gli amminoacidi possono essere forniti in un mix definito o nella forma di proteine idrolizzate, come lattoalbumina o derivati delle piante idrolizzati, come colza e riso.

Glucosio

Il glucosio è il principale carboidrato per la crescita cellulare animale, agendo come sorgente sia di carbonio che di energia, aggiunto ad una concentrazione di 5-25 mM. Il glucosio è metabolizzato principalmente attraverso la glicolisi, formando piruvato, che può essere convertito in lattato o acetile che può entrare nel ciclo dell’acido citrico, formando anidride carbonica e acqua.

Il glucosio è fondamentale e viene fornito in elevate quantità. L’eccesso di glucosio porta ad un’eccessiva attivazione della glicosilazione a discapito del ciclo di Krebs. Quindi, si svolge molta più glicolisi rispetto al ciclo di Krebs. Questo rappresenta un male perché normalmente i due processi avvengono nelle stesse quantità e le condizioni, quindi, sono diverse dalla condizione naturale. Si fa questo perché è molto più semplice per la proliferazione. Una volta stabilizzate si può decidere se diminuire il glucosio e aggiungere altri fattori di crescita. Il glucosio aumenta la glicolisi e cambia l’equilibrio metabolico delle cellule.

Vitamine

La maggior parte delle vitamine solubili in acqua sono presenti nel mezzo basale a differenti concentrazioni. Le vitamine idrosolubili che non sono presenti nel mezzo vengono aggiunte con il siero. Le vitamine liposolubili sono presenti in pochi mezzi ricchi. Di solito sono aggiunte con il siero. Nei terreni liberi da siero entrambi i tipi di vitamine sono forniti a basse quantità. La concentrazione delle vitamine è definita empiricamente in base alla linea cellulare e alle condizioni della coltura.

Terreno cellulare completo

I mezzi basali sono di solito ineffic