Biologia molecolare - Parte 1

2022 - Biologia molecolare

Storia

La data di nascita della biologia molecolare viene fatta coincidere con la scoperta da parte di Watson e Crick della struttura della doppia elica di DNA, verificatosi nel 1953. Prima di questa data ci sono stati eventi che hanno portato alla scoperta da un lato del DNA come materiale genetico e dall'altro la sua organizzazione a doppia elica. Le scoperte sono suddivise in tre colonne, la ricerca in questi tre ambiti della biologia è andata avanti indipendentemente dagli altri. Soltanto quando le scoperte nei vari campi che vanno dalla genetica alla biochimica alla fisica sono riusciti a convergere, in quel momento è stato possibile la nascita della biologia molecolare.

Ulteriori approcci sperimentali nuovi

• 1885/94 - A. Kossel identifica la presenza di basi azotate nella nucleina.
• 1889 - R. Altman definisce la nucleina acido nucleico.
• 1912 - W.H. Bragg e W.L. Bragg introducono la cristallografia a raggi X per determinare la struttura delle macromolecole.
• 1930 - Astbury e Bernal analizzano proteine e acidi nucleici. Grazie ai risultati ottenuti con questa tecnica è stato possibile capire come sono fatte le proteine.
• 1938 - Warren Weaver, direttore della divisione di scienze naturali della Rockefeller Foundation, fu il primo a usare l'espressione "biologia molecolare" per designare questo nuovo ramo della biologia che usava tecniche fisiche come la diffrazione a raggi X, ultracentrifugazione, elettroforesi per studiare le macromolecole presenti negli organismi.
• 1940 - Si costituisce il "Phage group", di cui fanno parte alcuni ricercatori come Max Delbrück, Salvatore Luria, Alfred Hershey.
• 1944 - Erwin Schrödinger, nel suo libro "What is life", fu il primo a proporre il gene come portatore di informazione genetica.

I biologi molecolare per poter conoscere le proprietà delle macromolecole utilizzano degli approcci completamente nuovi fino a quel momento. Ci sono i tre più importanti esperimenti che hanno portato alla dimostrazione che il DNA è il materiale genetico, vengono utilizzati approcci sperimentali nuovi, non ci si basa più soltanto sull'osservazione della morfologia, come quando venivano per esempio osservati i cromosomi al microscopio, non ci si basa più soltanto sull'analisi biochimica del materiale e quindi sapere solo che tipo di molecole ci sono, ma vengono appunto utilizzati degli approcci nuovi che permetteranno di capire come funzionano queste molecole:

• F. Griffith 1928
• O. Avery, C. Mac Leod e M. McCarty, 1944
• A. Hershey e M. Chase, 1952

Esperimento di Griffith

Il primo di questi esperimenti, che poi porterà negli anni successivi alla dimostrazione che il DNA è il materiale genetico, viene condotto nel 1928 da un medico inglese Frederick Griffith. Quello che lui dimostrò in questo esperimento non è ancora che il DNA è il materiale genetico, ma lui dimostra con questi esperimenti quello che chiama un "principio trasformante ereditabile".

Lui aveva dei pazienti che si erano ammalati di polmonite, sapeva che questa polmonite era provocata da un batterio che si chiama Streptococcus pneumoniae, o chiamato anche pneumococco. Riuscì ad isolare due tipi diversi di pneumococco, che erano distinguibili morfologicamente, quindi dal punto di vista del loro fenotipo, perché in un caso formavano delle colonie sulle piastre di agar che avevano una superficie liscia e per questo vengono indicati con la sigla S dall'inglese smooth, cioè liscio.

L'altro tipo di pneumococco formava delle colonie più piccole ma con una superficie ruvida, dall'inglese rough, cioè ruvido. Questo aspetto delle colonie corrispondeva a due fenotipi di questi batteri, nel caso dei batteri S corrispondeva al fatto che i batteri avevano una capsula polisaccaridica che conferiva appunto questo aspetto liscio alle colonie, mentre quelli R erano privi della capsula e quindi per questo avevano questo aspetto rugoso. A questa differenza fenotipica era associata anche un'altra caratteristica: i batteri S erano patogeni, quindi, erano in grado di provocare la polmonite, mentre i batteri R erano innocui.

Griffith decide di condurre un esperimento in vivo utilizzando dei topi e vede che quando inietta i batteri di tipo S nei topi, i topi muoiono perché appunto i batteri di tipo S sono patogeni. Quando dal topo morto va a recuperare dal sangue dei batteri, vede che sono tutti dello stesso tipo; quindi, questo vuol dire che i batteri erano entrati all'interno del topo, si erano moltiplicati e quindi per questo venivano trovati lo stesso tipo. Quando invece inoculava i batteri di tipo R, essi non avevano nessun effetto, il topo non moriva.

E. Chargaff va avanti con i suoi esperimenti e prova a prendere i batteri S e a scaldarli ad alte temperature, questi vengono poi inoculati in un topo, e il topo non subisce nessun effetto, questo vuol dire che i batteri S portati ad alte temperature erano morti e quindi non erano più in grado di infettare il topo. Allora decide di mescolare i batteri S morti con dei batteri R, li inocula nel topo e il topo muore, questo voleva dire che qualcosa che era presente nei batteri S, nonostante i batteri S fossero morti, qualche componente cellulare era stato trasferito nei batteri R.

Non solo, ma quando dal topo morto si andava a recuperare i batteri, si ritrovavano dei ceppi dei batteri S. Il risultato stava ad indicare che un componente chimico di una delle cellule S si è trasferito all'interno delle cellule R, era stato in grado di modificare e trasformare le cellule R. Quindi questo esperimento ha dimostrato che esiste un componente chimico, questo componente chimico era in grado di trasformare un tipo di batterio in un altro, ma era anche in grado di essere trasmesso alle generazioni successive di batteri, perché i batteri che vengono ritrovati nel corpo del topo sono anche di tipo S; quindi, voleva dire che questo componente chimico era in grado di essere trasmesso alle generazioni successive. Questo rendeva il componente chimico un probabile portatore di informazione genetica.

Ipotesi sul DNA come portatore di informazione genetica

Era noto che le possibili molecole che avrebbero potuto essere portatori di informazione genetica potessero essere il DNA o le proteine. Le proteine erano già state studiate con un certo dettaglio, quindi si conosceva che le proteine erano dei polimeri costituiti dall'unione di 20 diversi amminoacidi, dall'altro canto si sapeva che le unità fondamentali del DNA sono soltanto 4, quindi che questo componente chimico potesse essere il DNA era ritenuto poco probabile. Questo grafico riporta il peso molecolare medio delle molecole di DNA nei diversi anni, a partire dalla fine dell'800 fino ad arrivare agli anni '80 del secolo scorso. Tra la fine dell'800 e l'inizio del '900, le dimensioni medie degli acidi nucleici erano intorno a 10³ che è proprio il peso molecolare di un tetranucleotide.

Le tecniche di isolamento degli acidi nucleici erano tali da rendere impossibile l'isolamento di molecole di DNA molto lunghe, le molecole di DNA si spezzettavano durante la procedura di purificazione, quindi la stima del peso molecolare, quello che si riusciva ad ottenere si riferiva a frammenti di DNA molto piccoli. Invece, a partire dagli anni '20, il peso molecolare medio del DNA che veniva isolato aumenta con il miglioramento delle tecniche di isolamento. Quindi in quel momento pensando che un acido nucleico non potesse essere più grande di quelle dimensioni rendeva impossibile credere che potessero rappresentare la molecola portatrice di informazione genetica.

L'esperimento di Avery

L'esperimento successivo è meglio noto come la "bomba di Avery". Avery e i suoi collaboratori, Mac Leod e McCarty, nel 1944, decidono di ripartire dai dati pubblicati da Griffith per riproporre lo stesso esperimento, ma in vitro. Ripartono dai batteri S uccisi con il calore e mescolati con i batteri R vivi inoculati nel topo e vanno a prelevare nel topo morto i batteri S che dovevano contenere il principio trasformante, quindi decidono di estrarre e isolare questo principio trasformante per cercare di capire se si trattasse di proteine o DNA.

Una volta isolati i batteri S vengono fatti crescere su delle piastre di agar e inoculati in un terreno liquido. Una volta ottenute le cellule, faranno un estratto cellulare, quindi prendono le cellule e cercano di frazionare tutto il contenuto cellulare nei diversi componenti:

• Le proteine
• L'RNA
• Il DNA
• I lipidi
• I polisaccaridi

Vengono suddivisi ciascuno in un campione separato e ad ognuno di questi campioni vengono aggiunti pneumococchi R vivi. La miscela di pneumococchi vivi e ciascuno dei diversi componenti cellulari dei batteri S vengono fatti crescere su piastre di agar, questo per andare a visualizzare in quale dei diversi casi si otteneva una trasformazione, cioè crescere dei batteri che erano di tipo S anziché di tipo R. Dall'analisi delle diverse piastre, soltanto nel caso del DNA si osservava la crescita di batteri S sulla piastra.

Prima abbiamo visto che Avery opera un frazionamento cellulare, quindi una separazione delle diverse macromolecole presenti all'interno dell'estratto cellulare. Tuttavia le tecniche di purificazione e frazionamento a quei tempi non erano estremamente curati, quindi l'estratto che conteneva il DNA e che era in grado della trasformazione dei batteri R in batteri S, avrebbe potuto ancora contenere altri componenti. Quindi avere l'ulteriore conferma del loro risultato prendono l'estratto cellulare e lo trattano con degli enzimi che sono in grado di degradare selettivamente i diversi componenti cellulari.

In un primo caso iniziano aggiungendo una proteasi, cioè un enzima in grado di produrre la degradazione di tutte le proteine. L'estratto privo di proteine, era ancora in grado di produrre la trasformazione dei batteri. Lo stesso esperimento viene ripetuto aggiungendo, anziché la proteasi, la ribonucleasi pancreatica, cioè un enzima in grado di degradare completamente l'RNA e lo stesso l'estratto era in grado di produrre la trasformazione. Soltanto quando all'estratto viene aggiunta l'enzima deossiribonucleasi pancreatica, cioè un enzima che degrada completamente il DNA, solo in questo caso la trasformazione dei batteri R in batteri S non avviene; quindi, questa era la conferma definitiva che il principio trasformante fosse il DNA.

Processo di trasformazione cellulare

Che cosa succedeva alle cellule durante questa trasformazione? Avery tentò di dare una spiegazione che a quei tempi non potevano darsi. Noi oggi sappiamo la spiegazione. Partiamo con la cellula patogena liscia con evidenziato un gene chiamato cap S, che è il gene che codifica per la proteina che va a costituire la capsula delle cellule stesse. Quando le cellule di tipo S venivano scaldate e quindi uccise, si aveva la frammentazione di tutta la cellula e quindi anche del DNA, questi frammenti, una volta che la cellula uccisa al calore veniva mescolata con le cellule di tipo R, frammenti di DNA che si erano prodotti nella cellula S erano in grado di penetrare la cellula di tipo R, in questo caso l'ingresso dei vari frammenti tra questi il frammento cap S. Le cellule R erano diverse dal punto di vista della capsula, proprio perché il gene era mutato, cioè un gene cap R, perché la proteina coinvolta nella sintesi della capsula non funzionava; infatti, le cellule R erano prive della capsula. Quello che succedeva una volta che il frammento cap S entrava era un evento di ricombinazione omologa tra i due geni, cap S e cap R, che portava alla trasformazione della cellula da batterio di tipo R a batterio di tipo S, quindi c'è uno scambio dei tratti.

Nonostante i dati di Avery fossero così chiari nell'indicare che il DNA dovesse essere il portatore dell'informazione genetica, una parte della comunità scientifica continuava a sostenere che questo non fosse possibile e che dovessero essere le proteine i portatori dell'informazione genetica, sempre con l'idea che offrissero una maggiore variabilità.

Esperimento del frullatore di Hershey e Chase

L'esperimento che pone fine a questi dubbi è il famoso esperimento del frullatore effettuato da Alfred Hershey e Martha Chase nel 1952 utilizzando il batteriofago T2 e cellule di Escherichia coli. Hershey faceva parte del gruppo del fago, questo gruppo era spinto dall'idea che studiando questi organismi così semplici sarebbe stato più facile riuscire a trovare le spiegazioni di tanti meccanismi; quindi, usano il batteriofago T2 che era in grado di infettare delle cellule di Escherichia coli.

I batteriofagi possono avere un ciclo litico o un ciclo isogenico. Nel ciclo litico una particella fagica si lega alla superficie esterna di una cellula batterica e inietta del DNA all'interno dell'ospite. Una volta all'interno, noi oggi sappiamo che il materiale genetico del fago è in grado di sfruttare tutti i macchinari enzimatici della cellula batterica per riprodurre tante molecole di DNA fagico e successivamente trascrivere e tradurre le proteine che vanno a fare parte dell'involucro esterno del fago. Una volta ottenute l'assemblaggio delle nuove particelle fagiche queste provocano la lisi della cellula batterica.

Il gruppo del Fago stava quindi studiando i meccanismi delle infezioni da parte dei batteriofagi e la riproduzione dei fagi stessi. Quello che loro sapevano all'epoca è che il fago rappresentava un sistema estremamente semplificato, e fu probabilmente utile per chiarire, in modo definitivo, quale molecola dovesse essere responsabile dell'informazione genetica, perché si sapeva che il fago aveva una molecola di DNA all'interno della testa, mentre tutte le altre strutture erano completamente di natura proteica. Loro pensano di marcare questi due componenti del fago in modo diverso per distinguerle.

Erano già disponibili all'epoca la sintesi delle molecole che erano i precursori delle due macromolecole, quindi avevano un precursore del DNA e un precursore delle proteine. Questi precursori sono stati fatti in maniera tale da contenere due isotopi specifici, si sapeva che il DNA era costituito da nucleotidi e quindi per marcare il DNA si utilizzò un nucleotide nel quale il fosfato in posizione alfa fosse stato sostituito dall'isotopo 32 radioattivo P. Dall'altra parte si sapeva che le strutture esterne erano costituite da proteine e si sapeva anche che due amminoacidi, la cisteina e la metionina, contengono un atomo di zolfo, quindi si utilizzarono due di queste molecole con l'atomo di zolfo sostituito con l'isotopo 35 radioattivo dello stesso, quindi con l'isotopo S. In questo modo era possibile ottenere la marcatura selettiva dei due tipi di molecola.

Per ottenere la marcatura di queste due molecole hanno permesso ai fagi di infettare delle cellule di escherichia coli che stanno crescendo in un terreno liquido che contiene i due precursori. Si ha una beuta con un terreno contenente dei nucleotidi che sono marcati con il fosforo 32, questo vuol dire che le cellule di escherichia coli e i batteriofagi che infettano che infettano escherichia coli all'interno di quel mezzo, cresceranno e si riprodurranno e avendo a disposizione questo nucleotide, esso sarà incorporato nel DNA di nuova sintesi. Quindi tutti i fagi che si produrranno da queste cellule cresciute in questo terreno saranno marcati con il fosforo 32. Poi abbiamo una beuta con un terreno contenente amminoacidi marcati con l'isotopo dello zolfo 35, i fagi 35 vengono fatti crescere in questo terreno presenteranno tutte le loro proteine marcate con l'isotopo S.

Alla fine, si isolano da una parte i fagi marcati P 32 e dall'altra i fagi marcati S 35, e questi fagi vengono utilizzati per infettare dei nuovi batteri in un nuovo terreno che non contiene marcature, il contatto tra questi fagi e questi nuovi batteri viene mantenuto solo per un tempo limitato. Loro sapevano che la fase iniziale dell'infezione fagica del materiale era trasferito dal fago all'interno del batterio, mentre una parte dell'involucro proteico rimaneva all'esterno, quello che non sapevano era se il materiale che entrava nelle cellule fosse soltanto il DNA oppure era DNA con proteine.

Quindi fanno procedere questa infezione per un tempo limitato, poi usano il frullatore, in modo tale che l'agitazione meccanica del frullatore potesse staccare le porzioni proteiche che rimanevano all'esterno della cellula batterica. Una volta passate nel frullatore, le cellule venivano centrifugate e successivamente alla centrifugazione si otteneva un pellet e un sopranatante, il pellet corrispondeva alle cellule batteriche e tutto il materiale del fago che era entrato all'interno del batterio, mentre nel sopranatante rimanevano le parti di involucro proteico rimaste all'esterno. Quello che loro vanno a fare è misurare il tipo e la quantità di radioattività presente sia nel sopranatante che nel pellet.

La radioattività derivante dallo zolfo 35, quindi quella esclusiva alle proteine, si trova solo nel sopranatante, mentre il pellet non risultava marcato. Nell'esperimento in cui si è marcato i fagi con fosforo 32, dopo la misura della radioattività si osserva che il sopranatante in questo esperimento è privo di radioattività, mentre il pellet che contiene cellule batteriche con all'interno il fago è marcato.