Biologia molecolare

Unifi - Scienze Biologiche Biologia Molecolare

Prima Parte

Prof.ssa Tania Fiaschi

Programma

Membrana e trasporto. I lipidi della membrana plasmatica. Fluidità della membrana ed il colesterolo. Il trasporto attivo e passivo. Il trasporto del glucosio. Trasportatori costitutivi ed inducibili del glucosio. Esocitosi ed endocitosi.

Sede dell’informazione genica ed organizzazione del genoma. Dogma della biologia, esperimento di Griffith, istoni, denaturazione del DNA.

La replicazione del DNA. La struttura degli acidi nucleici. Gli enzimi che partecipano alla duplicazione del DNA. La forcella di replicazione ed il meccanismo di inizio della duplicazione del DNA nei procarioti e negli eucarioti. La telomerasi.

La PCR. Meccanismo della PCR.

La trascrizione. Il meccanismo della trascrizione.

La maturazione degli RNA. Maturazione del tRNA e dell’mRNA (aggiunta cappuccio al 5’, splicing, coda poliA, editing).

Il codice genetico, la traduzione e le mutazioni. I codoni, il meccanismo della sintesi proteica, incorporazione della selenocisteina, gli chaperoni molecolari, il proteasoma.

Il controllo dell’espressione genica. I meccanismi epigenetici, i fattori trascrizionali, l’RNA interference, il controllo traduzionale (esempio della ferritina e del recettore della transferrina).

Il destino post-traduzionale delle proteine. La via citoplasmatica (trasporto di proteine nel nucleo, mitocondrio, perossisomi). La via vescicolare (trasporto di proteine nel reticolo). N-glicosilazione delle proteine nel RE.

Il traffico vescicolare. Via secretoria costitutiva, regolata e via endocitica.

Membrana plasmatica e trasporto

La membrana crea una barriera tra citosol (e tutti i suoi organelli) e l’ambiente extracellulare.

• Ambiente extracellulare: mantiene intatta l’omeostasi cellulare, inalterate le concentrazioni di soluti che si trovano all’interno: ioni, zuccheri, lipidi…
• Per mantenere le concentrazioni costanti la cellula deve regolare il trasporto dei soluti tra esterno ed interno e viceversa: questa regolazione è alla base del mantenimento dell’omeostasi à regolazione trasporto sostanze.
• Interazione fisica tra cellule: grazie alle proteine sulla membrana plasmatica le cellule prendono contatto tra di loro.
• Interazione fisica con strutture extracellulari: cioè la matrice extracellulare, che è una sorta di pavimento su cui tutte le cellule del nostro corpo sono attaccate (a parte il sangue). Per sopravvivere devono rimanere attaccate e ci riescono grazie alla membrana plasmatica.

Come è fatta? È una struttura lipidica fatta quindi da lipidi in particolare da fosfolipidi e uno steroide particolare il colesterolo. Sono detti antipatici perché hanno testa polare idrofila e coda idrofobica dipolare.

I fosfolipidi possono essere di due tipi a seconda dello scheletro di cui sono costituiti:

• Glicerofosfolipidi: scheletro di glicerolo, il quale è una molecola a 3 atomi di carbonio, 2 acidi grassi attaccati a 2C uno ciascuno.
• Sfingofosfolipidi: scheletro di sfingosina.

I glicerofosfolipidi sono lipidi di membrana che hanno come struttura una molecola di glicerolo a cui sono legati 2 acidi grassi su due dei 3 atomi di carbonio, uno su C1 e uno su C2, attraverso i loro gruppi carbossilici. Possono essere sia saturi che insaturi à influiscono mobilità membrana plasmatica. Al terzo carbonio si lega, innanzitutto, un gruppo fosfato. Quando il glicerolo è legato a 2 acidi grassi più gruppo fosfato ancora non si porta di glicerofolipide ma di acido fosfatidico (precursore dei glicerofosfolipidi).

Steroidi. Sono tra i più importanti: il colesterolo che è una struttura ad atomi di carbonio uniti tra loro a formare anelli. Particolarità è che presenta gruppo OH che serve al colesterolo per legarsi ai fosfolipidi di membrana:

• Costitute dalle membrane biologiche;
• Precursore di molte molecole biologiche: ormoni steroidei, vitamina D, acidi biliari.

Fluidità della membrana e colesterolo

Come si muove la membrana? A seconda dell’aumentare della temperatura, passiamo da una fase di gel a una fase fluida, la temperatura viene detta temperatura di transizione.

La mobilità dipende da:

• Lunghezza acidi grassi e fosfolipidi
• Grado di sottrazione degli acidi grassi che formano fosfolipidi.
• Presenza di colesterolo

Perché la lunghezza è in particolare la sottrazione influenzano la mobilità della membrana? Perché più un acido grasso è lungo, più avrà bisogno di spazio per poter essere inserita nel doppio strato e avendo bisogno di più spazio blocca movimento dei fosfolipidi adiacenti la lunghezza diminuisce à fluidità.

La presenza di acidi grassi insaturi, quindi con doppi legami, aumenta la fluidità della membrana à c’è più mobilità (rispetto a quelli Saturi) perché se li mettiamo impacchettati fosfolipidi formati da acidi grassi saturi, si avrà struttura lineare perché si impacchettano bene le code. Se invece abbiamo fosfolipidi con acidi grassi insaturi, nel punto in cui c’è insaturazione (doppio legame) si forma una curvatura perché non si impacchettano bene.

Cosa fa il colesterolo? Diminuisce la mobilità delle membrane plasmatiche perché attraverso il gruppo OH perde forma un legame ad H con quello che era il gruppo carbossilico dell’acido grasso che si è legato al glicerolo e si interpone tra i glicerofosfolipidi, facendo ciò occupa lo spazio e i fosfolipidi accanto al colesterolo non si possono più muovere. Ci sono però delle zone della cellula che sono per loro natura caratterizzati da una grossa percentuale di colesterolo à quindi sono strutture Rigide senza possibilità di movimento.

Ci sono regioni dette raft lipidici: sono microdomini planari di circa 70 nm di diametro ricchi in colesterolo e sfingolipidi (sfingomielina, glicolipidi) che creano una fase ordinata di lipidi strettamente impacchettati e meno fluidi. Possono essere lineari e invaginati: strutture dette caveola ricche di caveolina. I raft servono a captare i segnali dell’ambiente extracellulare e a portarli all’interno della cellula.

I movimenti dei fosfolipidi sono in tutto 3: rotatorio, traversale e flip-flop (raro perché sfavorito dal punto di vista energetico, avviene durante l’apoptosi cellulare: movimento flip-flop della fosfatidilserina.

Tipi di trasporto della membrana plasmatica

Tipi di trasporto della membrana plasmatica:

Trasporto passivo:

• Diffusione semplice
• Diffusione facilitata
• Osmosi

Trasporto attivo:

• Trasporto attivo primario
• Trasporto attivo secondario

La diffusione avviene grazie a proteine di membrana, proteine di trasporto cioè canali.

Diffusione semplice gas attraversano tranquillamente doppio strato fosfolipidico. à Diffusione facilitata grazie a strutture proteiche con canali sempre aperti o proteine di trasporto dove cambiano conformazione.

I trasportatori del glucosio entra con trasporto attivo facilitato. Si chiamano GLUT e sono divisi in due tipi:

Costitutivi: GLUT1 e GLUT2. I costitutivi si trovano sempre nello stesso numero in qualsiasi momento di vita cellulare, perché la concentrazione è mantenuta inalterata nella membrana plasmatica.

Inducibili: GLUT4. Vengono espressi e portati nella membrana plasmatica solo quando servono. A differenza delle costitutive cambiano il loro numero perché hanno bisogno di ATP.

Dal punto di vista cinetico, la diffusione semplice aumenta la velocità all’aumentare della concentrazione.

Osmosi

Il termine osmosi indica la diffusione del solvente (spesso acqua) attraverso una membrana semipermeabile (che fa passare quindi solvente e non soluto). Il movimento dell'acqua avviene da una regione a minor concentrazione di soluto verso una regione a maggior concentrazione, quindi secondo il gradiente di concentrazione, cioè l'attività.

L'osmosi è un processo fisico spontaneo, vale a dire senza apporto esterno di energia, che tende a diluire la soluzione più concentrata, e a ridurre la differenza di concentrazione. Il flusso netto di solvente può essere contrastato applicando una pressione al compartimento a concentrazione maggiore. Se la pressione applicata supera la pressione osmotica, otteniamo l'osmosi inversa.

Si tratta di un fenomeno importante in biologia, dove interviene in alcuni processi di trasporto passivo attraverso membrane biologiche.

Endocitosi

L'endocitosi è un processo riguardante la periferia cellulare, attraverso il quale la cellula internalizza molecole o corpi presenti nello spazio extracellulare in maniera massiva tramite la modificazione della forma della sua membrana plasmatica, che crea uno spazio per racchiudere il materiale da introdurre nella cellula in una vescicola, detta "vescicola endocitica". Questa vescicola viene quindi convogliata nel citoplasma tramite microtubuli.

Esocitosi

L'esocitosi è il processo cellulare con il quale la cellula riversa al suo esterno (ovvero nel liquido extracellulare) delle molecole accumulate all'interno di una vescicola, tramite la fusione di quest'ultima con la membrana plasmatica. Tale vescicola è limitata da una membrana e originata dall'apparato di Golgi per vescicolazione. Il suo contenuto può essere costituito da proteine, sintetizzate dai ribosomi legati al reticolo endoplasmatico rugoso (RER), all'interno del quale le proteine subiscono differenziazione per mezzo di aggiunta di gruppi glucidici e lipidici formando glicoproteine e lipoproteine che poi sono espulse tramite esocitosi, o molecole a basso peso molecolare, come i neurotrasmettitori sintetizzati nel citoplasma e immagazzinati nelle vescicole dette, in questo caso, sinaptiche tramite il trasporto attraverso la loro membrana per mezzo di specifici trasportatori proteici.

Gli acidi nucleici

Negli organismi viventi si trovano due tipi di acidi nucleici:

• DNA (acido desossiribonucleico)
• RNA (acido ribonucleico).

Tutti gli organismi contengono acidi nucleici sotto forma di DNA e RNA.

Il DNA è il depositario dell'informazione genetica che viene trascritta – ossia copiata - in molecole di RNA. L'RNA decodifica le informazioni presenti nel DNA e con queste ultime vengono utilizzate per sintetizzare le specifiche proteine.

Lo zucchero dell'RNA è il ribosio; quello del DNA è il deossiribosio o desossiribosio, che si differenziano in quanto il desossiribosio ha un atomo di ossigeno in meno rispetto al ribosio.

In entrambe le sostanze vi sono due tipi di basi azotate:

• Puriniche (anello doppio): adenina e guanina
• Pirimidiniche (anello semplice): timina, citosina e uracile (derivanti rispettivamente dalla purina e dalla pirimidina).

Le basi azotate che costituiscono il DNA sono adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T). Le basi azotate che costituiscono l'RNA sono adenina (A), guanina (G), citosina (C) e uracile (U). La doppia elica di DNA accoppia una pirimidina e una purina, l'adenina si accoppia con la timina e la citosina con la guanina. L'RNA (anche se singola catena) accoppia durante le trasmissioni e le traduzioni l'adenina all'uracile (la timina non è presente nell'RNA) e la citosina alla guanina.

Nei batteri e nelle cellule di organismi superiori, sono presenti entrambi; alcuni virus possiedono solo l'RNA (ad esempio quello della poliomielite o quello dell'AIDS); altri solo il DNA. Negli eucarioti, il DNA si trova nel nucleo e nel mitocondrio, mentre l'RNA si trova nel nucleo, ma soprattutto nel citoplasma. Al DNA spetta il mantenimento dei caratteri ereditari, mentre all'RNA spettano altre mansioni, quale la trasmissione delle informazioni contenute nel DNA verso i siti di sintesi proteica.

RNA e DNA sono molecole molto complesse: è quindi probabile che risultino dall'evoluzione di molecole esistenti precedentemente. Sebbene i loro antenati siano scomparsi dalle attuali forme viventi, sono stati creati in laboratorio diversi acidi nucleici sintetici che possiedono, ad esempio, altri zuccheri come scheletro della molecola. Un acido nucleico particolarmente interessante per queste ipotesi è il TNA (acido treofuranosilnucleico).

Organizzazione del genoma

L’organizzazione del cromosoma nel nucleo interfasico è il nucleolo: è la zona in cui si raggruppano i tratti di DNA che codificano gli RNA ribosomici appartenenti a cromosomi diversi. Questa è la regione in cui avviene la sintesi degli RNA ribosomici e dove essi si associano con le loro proteine specifiche per formare i ribosomi, le macchine molecolari responsabili della sintesi proteica. Le proteine che si legano al DNA e danno forma ai cromosomi eucariotici si dividono in due classi principali: gli istoni e le proteine cromosomiche non istoniche. Gli istoni sono presenti in quantità enormi. Prende il nome di cromatina il complesso del DNA nucleare e delle sue proteine appartenenti alle due classi.

Gli istoni sono responsabili del primo e più importante livello di organizzazione della cromatina, il nucleosoma. Il DNA avvolto intorno a un nucleo di proteine istoniche.

Una singola particella nucleosoma consta di un complesso di otto molecole istoniche (istoni H2A, H2B, H3 e H4) e un tratto di DNA a doppio filamento lungo 147 nucleotidi che si avvolge intorno all’ottamero istonico. Il complesso discoidale istonico attorno a cui il DNA fa 1,7 giri avvolgendosi stretto e con andamento sinistrorso.

I quattro istoni del centro nucleosomico sono proteine piuttosto piccole con una notevole percentuale di amminoacidi a carica positiva (lisina e arginina). Tramite queste cariche positive gli istoni si legano con forza all’ossatura zucchero-fosfato del DNA, che ha carica opposta. Gli istoni del corpo centrale hanno una “coda” amminoacidica N-terminale che si proietta all’esterno della particella istonica. Queste code vanno incontro a vari tipi di modificazione covalente che controllano molti aspetti della struttura cromatinica. Gli istoni del corpo nucleosomico centrale sono quelle più fedelmente conservate nel corpo dell’evoluzione. I nucleosomi si ammucchiano gli uni sugli altri per dare luogo a una struttura compatta, questo effetto è dovuto all’istone H1, un quinto tipo di istone che pare induca i nucleosomi a raggrupparsi in un insieme ripetitivo ordinato. Questo istone “di connessione” devia il filmato in uscita dal corpo centrale della particella, agglomerando i nucleotidi adiacenti.

Le cellule eucariotiche intervengono localmente sulla struttura della cromatica in vari modi e in breve tempo. In certi casi si avvalgono dei complessi rimodellatori della cromatina, macchina proteica che usano energia di idrolisi dell’ATP per modificare la posizione del DNA avvolto sui nucleosomi. Un altro sistema per apportare variazione alla struttura cromatinica dipende dalla modificazione chimica reversibile degli istoni. Le code di tutti e quattro gli istoni del nucleo centrale vanno soggette a vari tipi di modificazioni covalenti: per esempio, esistono enzimi residenti nel nucleo che aggiungono e rimuovono gruppi acetile, fosfato o metile dai nucleosomi assemblati. Gli enzimi modificatori degli istoni lavorano di concerto con complessi rimodellatori per condensare o distendere tratti di cromatina, adattandone rapidamente la struttura a seconda delle esigenze cellulari.

La forma più densa della cromatina interfasica prende il nome di eterocromatina. Il tipo più comune di eterocromatina si forma a partire da un particolare gruppo di modificazione delle code istoniche, tra cui la metilazione del residuo in posizione 9 dell’istone H3. Tali modificazioni attraggono un gruppo di proteine specifiche per l’eterocromatina. Gran parte del DNA cellulare che rimane sempre nello stato eterocromatico non contiene geni: i geni cui capita accidentalmente di condensarsi in eterocromatina difficilmente riescono ad essere espressi, perché la struttura è troppo compatta. L’inclusione scorretta di geni nel processo di eterocromatizzazione può causare delle malattie.

Il resto della cromatina interfasica prende il nome di eucromatina. Pur intendendo con questo termine una cromatina più distesa dell’eterocromatina, risulta ormai chiaro che l’eucroatina e l’eterocromatina includono entrambe una miscela di strutture cromatiniche diverse.

Duplicazione del DNA

Nota: la prof. Fiaschi ha sottolineato il fatto che è importante ai fini dell’esame imparare il disegnino sulla duplicazione per esempio verso della DNA polimerasi, perché si formano i frammenti di okazaki etc. consiglio di guardare le slides.

La replicazione del DNA inizia nelle regioni chiamate ORI (origine), ricche di Adenina e Timina, per il semplice fatto che sono due basi azotate legate da due legami idrogeno, dopo di che viene caricata la DNA elicasi che apre la forca di replicazione rompendo i legami idrogeno. Si legano delle proteine per tenere i filamenti separati. L’enzima chiave per la duplicazione è la DNA polimerasi che sintetizza in direzione 5’P à 3’OH e ha la caratteristica di essere un enzima primer-dipendente, perché necessita di un piccolo frammento di nucleotidi preformati, il primer che utilizza la DNAp, formato da RNA sintetizzato dalla RNA primasi.

I due filamenti di DNA sono complementari e antiparalleli, così come i due filamenti sintetizzati dai filamenti parentali. Andando avanti accade che la DNAp viene attaccata sul filamento di DNA in direzione 5’P à 3’OH, replicando un filamento in modo Continuo; l’altro filamento, in cui la DNAp segue la stessa direzione si ha una replicazione in modo Discontinuo la quale però è opposta rispetto all’apertura della forcella di replicazione.

La DNAp in realtà è un enzima molto più complesso, oltre alla presenza di una pinza scorrevole, che permette l’attacco della DNAp (ricorda Ogni volta che si attacca