Biologia Molecolare - Appunti

Introduzione chimica

Tutti gli organismi sono costituiti da quattro tipi di molecole biologiche che svolgono ruoli essenziali:

• Nucleotidi => acidi nucleici (informazione genetica)
• Aminoacidi => proteine (enzimi, componenti strutturali della cellula)
• Zuccheri => varie funzioni (possono formare le glicoproteine)
• Lipidi => membrane cellulari e metabolismo

Le molecole biologiche esplicano la loro funzione in ambiente acquoso, infatti le cellule sono fatte per il 70-80% d'acqua. L'atomo è la più piccola unità di un elemento che mantiene le sue proprietà chimiche distintive. È anche costituito da particelle subatomiche cioè protoni, elettroni e neutroni che definiscono le proprietà di ciascun elemento chimico. L'atomo è elettricamente neutro, numero di protoni ed elettroni sono uguali. Ma le condizioni ambientali possono portare modifiche al numero di elettroni e perciò si forma lo ione, carico elettricamente. Gli atomi diversi si distinguono per il numero di protoni. Esistono anche gli isotopi che sono un atomo di uno stesso elemento chimico (stesso numero atomico Z) ma con differente numero di massa A, e quindi differente massa atomica M. La differenza dei numeri di massa è dovuta a un diverso numero di neutroni presenti nel nucleo dell'atomo a parità di numero atomico. Gli isotopi sono importanti per un discorso pratico, sono usati in esperimenti come traccianti per studiare determinate molecole (isotopi del fosforo per marcare gli acidi nucleici). Spesso gli isotopi sono radioattivi.

Una molecola può essere composta da più atomi di un solo elemento chimico o da atomi di elementi diversi. Gli atomi di una molecola sono tenuti insieme da legami covalenti che sono la forma di legame più stabile e con maggiore energia. Le molecole interagiscono tra loro con la formazione di legami non covalenti che danno la loro forma tridimensionale e governano le interazioni tra molecole biologiche.

Legame chimico

Il legame chimico rappresenta la forza d'attrazione che tiene uniti gli atomi. La forza di un legame è inversamente proporzionale alla distanza tra gli atomi (es. legame covalente H:H=0,7 A e legame a idrogeno H…H=1,2 A). Per i legami è molto importante il valore energetico, la forza di legame. I legami forti sono legami stabili che nei sistemi biologici difficilmente si rompono in modo spontaneo. Il più forte è il legame covalente. Mentre i legami deboli vengono rotti facilmente in condizioni fisiologiche e sono stabili solo quando sono numerosi. I legami deboli sono importantissimi per la formazione delle molecole biologiche. I legami deboli e forti determinano la struttura delle macromolecole.

• Legame covalente: I legami covalenti si formano quando gli elettroni vengono condivisi tra gli atomi di una molecola. La condivisione di una coppia di elettroni forma un legame singolo, mentre la condivisione di due coppie di elettroni forma il legame doppio. I legami covalenti sono molto stabili e contengono tanta energia perciò è necessaria una grande quantità di energia per romperli. La forza del legame covalente rende le macromolecole biologiche stabili nelle condizioni fisiologiche prevalenti nella cellula.
• Legami deboli: Sono quattro: Legami di van der Waals, Legami idrofobici, Legami idrogeno e Legami ionici. Per la formazione di macromolecole i legami deboli si basano sull'interazione di cariche elettriche. Tutte le molecole sono in grado di formare i legami di van der Waals, mentre solamente le molecole dotate di carica netta (ioni), o sulle quali la carica non è distribuita in modo uniforme possono formare legami idrogeno. Le interazioni di Van der Waals sono le più deboli, ma sono in grado di stabilizzarsi se in molteplice quantità. Le forze di van der Waals si realizzano tra le nuvole elettroniche degli atomi che costituiscono la superficie della molecola a una distanza di 5 A. Se le nuvole elettroniche degli atomi vicini sono opposte si attirano se sono uguali si respingono. Sono basati sulle fluttuazioni di carica indotte da molecole vicine. Perché tra due molecole ci possa essere un'interazione di questo tipo, devono esserci delle interazioni steriche ben precise così che la distanza fra gli atomi non siano molto diverse dei raggi di van der Waals. Una interazione di van der Waals molto stabile è quella che si ha alla base del riconoscimento di un anticorpo per il proprio antigene. La superficie dell'anticorpo crea tante interazioni di van der Waals con l'antigene.

L'elettronegatività è una misura della tendenza di un atomo ad attirare la nuvola elettronica nella sua direzione durante il legame chimico con un altro atomo. La scala di Pauling è un metodo ampiamente usato per ordinare gli elementi chimici secondo la loro elettronegatività. Ci sono elementi con una propensione elevata di attrarre elettroni di valenza, altri molto meno. Gli elementi importanti dal punto vista dell'elettronegatività sono ossigeno, azoto e carbonio. Questa tendenza consente di formare legami deboli ma con un contributo energetico importante. Quando un atomo molto elettronegativo è legato covalentemente ad uno poco elettronegativo quindi gli elettroni tendono verso l'atomo elettronegativo. Nell'HCl il cloro tende ad avere una parziale carica negativa, mentre l'idrogeno una parziale carica positiva perché tende a perdere il suo elettrone. Si forma un dipolo elettrico in quanto il centro della carica + non si sovrappone a quello della carica -. Grazie ai dipoli si possono formare legami deboli tra molecole.

Anche nelle molecole d'acqua si formano dipoli. Il legame idrogeno è un caso particolare di interazione fra dipoli. Il legame dipolo permanente - dipolo permanente in cui è implicato un atomo di H coinvolto in un legame covalente con elementi molto elettronegativi come N, O, o F. Questi atomi attraggono a sé gli elettroni di valenza, acquisendo una parziale carica negativa lasciando l'H con una parziale carica positiva. I legami H più importanti dal punto di vista biologico coinvolgono. Si formano atomi idrogeno dei gruppi OH o N-H. Gli atomi accettori a carica negativa sono solitamente l'N o l'O. Quando tra atomi accettori e donatori vi è una notevole differenza di carica il legame H che si forma è relativamente forte. Ad esempio lo vediamo negli amminoacidi come nella foto alato in cui l'ossigeno attira elettroni quindi la parziale carica - attira l'idrogeno di un gruppo ossidrile di un altro amminoacido.

Il legame ionico è una forma estrema di legame a idrogeno in cui l'elettrone non è più condiviso ma è risucchiato da un atomo. Le due entità non assumono più una carica parziale, ma una carica vera e propria. Molte molecole organiche possiedono gruppi ionici che contengono una o più cariche nette positive o negative es. i mononucleotidi hanno una carica netta negativa (gruppo PO₄). Queste cariche sono solitamente neutralizzate da gruppi dotati di una carica opposta e che si trovano nelle vicinanze. Le molecole idrofobiche tendono a raggrupparsi escludendo l'acqua e formando strutture sferiche. Quando una molecola idrofobica si trova nell'acqua questa tende a formare strutture ordinate intorno ad essa (clatrati) e ciò diminuisce l'entropia del sistema. Se sono presenti più molecole idrofobiche si raggrupperanno tutte insieme in modo da minimizzare l'ordine delle molecole d'acqua nelle condizioni di massima entropia. Sono in grado di farlo gli anelli aromatici delle basi azotate del DNA. le interazioni idrofobiche guidano la formazione della doppia elica, con le basi nel DNA aromatiche all'interno e lo scheletro zucchero-fosfato, polare/carico, esposto all'acqua.

La struttura delle macromolecole è determinata da legami deboli e forti. Soprattutto quando macromolecole diverse devono interagire tra loro i più importanti sono i legami deboli che ne conferiscono una grande specificità. Le proteine capaci di legare il DNA sono di importanza fondamentale per molti processi biologici. Le proteine possono interagire con il DNA in diversi modi: Mediante il riconoscimento di specifiche sequenze di basi oppure mediante il riconoscimento di particolari conformazioni della doppia elica. Le proteine che legano il DNA a singola elica (single-strand DNA binding proteins, SSB) hanno un'alta specificità per il DNA a singolo filamento (ssDNA). Le catene laterali degli aa interagiscono i P dello scheletro del DNA oppure si intercalano tra le basi. Nell'immagine vediamo delle interazioni tra le basi dell'acido nucleico e le catene laterali della proteina e formano interazioni idrofobiche e legami a H in modo tale che la proteina interagirà esclusivamente con quella sequenza di DNA. La maggior parte delle proteine che legano il DNA riconoscono sequenze specifiche della doppia elica.

Il DNA a doppia elica è caratterizzato: dal solco maggiore, più ampio e dal solco minore, più stretto. Solitamente un'a-elica si inserisce nel solco maggiore. Si formano interazioni deboli tra DNA e la superficie dell'a-elica. Si formano legami H specifici tra le basi e le catene laterali degli aa. Le a-eliche possiedono un momento di dipolo che rende l'estremità N-terminale carica + così da formare legami deboli con i P dello scheletro del DNA. Le proteine che legano gli acidi nucleici espongono anche verso il DNA una porzione di proteina che tende ad essere ricca di amminoacidi a carica +. Tutti gli organismi viventi utilizzano energia chimica cioè l'energia contenuta nei legami dei composti e che viene liberata quando questi sono sottoposti a particolari reazioni. Le piante invece usano l'energia luminosa. Tutti i processi biosintetici (anabolici) sono endoergonici quindi il prodotto che si forma si arricchisce di energia. Le reazioni di degradazione (cataboliche) sono esoergoniche e si ha liberazione di energia. L'energia libera (G) è l'energia in grado di compiere un lavoro. Maggiore è la forza di un legame maggiore è la variazione di en. Libera. ΔG<0 indica una reazione esoergonica e spontanea. È una reazione che procede con rilascio di energia libera (il sistema si modifica verso uno stato che possiede meno energia libera). Se ΔG=0 il sistema è in equilibrio termodinamico. Se ΔG>0 la reazione non può avvenire spontaneamente la reazione è endoergonica. Il sistema guadagna energia libera. L'energia libera viene trasferita attraverso la formazione e la rottura di legami. Più forti sono i legami, maggiore è il ΔG, i legami covalenti hanno ΔG<<0. Ogni molecola è caratterizzata da una propria energia libera (ΔG). La differenza di DG è dovuta che i legami covalenti hanno energie diverse es. O-H >> O-O, H-H. Più forte è il legame, minore è l'energia libera che può rilasciare => le migliori fonti di energia sono le molecole caratterizzate da legami covalenti termodinamicamente instabili. Nei sistemi biologici le reazioni sono accoppiate cioè ci sono due reazioni in cui si rompe un legame e se ne forma un altro per non disperdere energia. le reazioni procedono formando intermedi di reazione. Tutti i processi degradativi hanno principalmente due scopi:

• La produzione di precursori di altre biomolecole
• La conservazione di una parte dell'energia libera della molecola degradata in una forma utilizzabile per le attività cellulari

Alcuni passaggi della degradazione sono accoppiati alla sintesi di molecole ad alta energia. L'ATP rappresenta la molecola ad alta energia di maggiore importanza biologica, è costituita da un nucleotide, ribosio e tre gruppi fosfato. Le molecole in grado di funzionare da accumulatori di energia contengono almeno un gruppo fosfato facilmente ionizzabile. ATP=Adenosine TriPhosphate. I legami anidride grazie al fosfato sono ad alta energia. L'ATP immagazzina energia e la libera perdendo un fosfato terminale per idrolisi, formando ADP=Adenosine DiPhosphate. La reazione è fortemente esoergonica (libera energia) e fornisce la “spinta” biochimica a processi endoergonici (e.g. contrazione muscolare). In alternativa nella cellula c'è anche il GTP che al posto della adenina come base ha anche la guanina. ATP è generata dalla fosforilazione ossidativa nel mitocondrio, fa da combustibile per un motore molecolare che è quello della tropomiosina che scorre su un filamento di actina. Il contenuto energetico dei vari legami di ATP è diverso. Il game più distale è alfa, quello successivo beta e infine gamma. Spesso una molecola di ATP viene utilizzata per superare l'energia di attivazione delle reazioni enzimatiche, attivando il substrato. Tutte le reazioni biosintetiche portano al rilascio di P ~ P che viene immediatamente scisso rendendo impossibile l'inversione della reazione biosintetica. Un esempio è nella sintesi delle proteine in particolar modo gli amminoacidi sono trasportati su ribosoma sul quale è legato aa che successivamente sarà incorporato grazie un legame covalente, perciò l'ATP dà energia alla reazione indirettamente aumentando il contenuto energetico dell'aa prima di legare il tRNA.

Acidi nucleici

Sono due: DNA (acido desossiribonucleico) e RNA (acido ribonucleico). Sono al centro del dogma centrale della biologia molecolare che rappresenta il flusso dell'informazione genetica dal DNA alle proteine che poi ne espletano le funzioni. Fu proposto da Francis Crick uno dei due scopritori della doppia elica ed è basato molto sul DNA. Il DNA come materiale genetico deve perpetuare dell'informazione genetica da una generazione all'altra attraverso alla sua replicazione o duplicazione. Dal DNA l'informazione genetica fluisce unidirezionalmente all'RNA attraverso la trascrizione e poi passerà con la traduzione alle proteine. In biologia però non esistono dogmi, infatti negli anni 70 si è scoperta l'esistenza di virus eucariotici che hanno l'RNA come materiale genetico. Alcune classi di virus per realizzare il contenuto informativo del loro materiale genetico devono obbligatoriamente riconvertire il loro RNA genomico in DNA attraverso la retrotrascrizione.

DNA e RNA sono entrambi in origine delle catene lineari polimeriche di un'unità fondamentale che sono i nucleotidi. Il DNA codifica l'informazione genetica che permette il mantenimento delle funzioni cellulari. L'RNA fa da intermedio ed è usato per la sintesi delle proteine. Nel 1869 Friedrich Miescher riuscì ad isolare dal nucleo delle cellule una sostanza collosa e fibrillare che chiamò nucleina. Separò le componenti della sostanza identificando la presenza dell'acido desossiribonucleico e proteine. Alla fine del 19esimo secolo chimici avevano scoperto il secondo acido nucleico, l'acido ribonucleico. In generale era stata scoperta la loro natura polimerica costituita dai nucleotidi.

Nell'800 era noto che le cellule prima di dividersi assemblano i cromosomi per poi passarli alle cellule figlie. Era chiaro che il nucleo doveva contenere l'informazione genetica, ma non si capiva chi tra DNA, RNA e proteine era responsabile della trasmissione. Nel 1928 un medico militare inglese che curava i malati di polmonite Fredrick Griffith dimostrò che i batteri contengono del materiale che è in grado di trasmettere l'informazione genetica da una generazione all'altra. Lui definì l'esistenza di un agente trasformante. Il sistema modello di Griffith è il topo infettato da un ceppo di batteri che causa polmonite (staffilococchi). Usò il ceppo smooth e il ceppo rough il quale però ha una mutazione nelle proteine di membrana che li rende molto più suscettibili all'attacco del sistema immunitario dell'ospite. Iniettando il ceppo r il topo non sviluppa la polmonite. Mentre il ceppo s forma una capsula sono molto più resistenti al sistema immunitario, quindi i topi si ammalano e muoiono.

L'esperimento di Griffith dice che la proprietà di formare colonie smooth poteva essere trasferita da un ceppo smooth a uno rough. Prese dei batteri di ceppo s e li inattivò scaldandoli e li inserì in un topo. Di per sé il topo non presenta polmonite. Poi prese la soluzione con i batteri s inattivati e li mischiò con dei batteri vivi di ceppo r e lo iniettò nel topo che morì per polmonite. Dissezionò i topi e vide che nei tessuti polmonari si trovavano dei batteri s vitali. Aveva così ipotizzato l'esistenza di un principio trasformante in grado di trasferire l'informazione che dà origine a batteri di tipo s che in origine erano r.

Negli anni 30 molti ricercatori facevano diversi esperimenti per cercare di definire la natura del materiale genetico. Così furono identificati i cromosomi su cui si avevano le informazioni genetici. Anche i cromosomi come la nucleina sono composti principalmente da DNA e proteine. Molti credevano che fossero le proteine (più complesse) fossero il materiale genetico. Linus Pauling aveva appena identificato le proteine. Nel 1882 Flemming aveva visto i piccoli filamenti visibili nel nucleo, ma il nome cromosomi deriva da Waldeyer nel 1888, trattandosi di corpi visibili dopo essere stati colorati (chroma=colore esoma). Nel 1912 Morgan e Sturtevant capirono che i caratteri ereditari e quindi i geni sono portati dai cromosomi.

Nel 1944 Oswald Avery usò il sistema degli staffilococchi s e r per dimostrate con la degradazione selettiva delle tre macromolecole biologiche che è il DNA il principio trasformante. Usò batteri inattivati dal calore e di lisò (divide) e vide che all'interno di essi si riscontravano proteine, DNA e RNA. Si chiese