Biologia molecolare

Biologia molecolare

Prof. Sartori

Anna Pasinelli

Sommario

• 1. Introduzione alla biologia molecolare ......................................................................................... 2
• 2. La replicazione del DNA ...................................................................................................................... 14
• 3. Trascrizione ......................................................................................................................................... 29
• 4. Tecniche dell’ingegneria genetica – tecnologia del DNA ricombinante ................................... 42
• 5. Tecniche per l’analisi dell’espressione genica su ampia scala .................................................... 55
• 6. Trascrizione negli eucarioti ............................................................................................................. 58
• 7. VHL .......................................................................................................................................................... 70
• 8. Traduzione ........................................................................................................................................... 72
• 9. Utilizzo degli animali transgenici .................................................................................................... 84

1. Introduzione alla biologia molecolare

La biologia molecolare è lo studio dei meccanismi molecolari degli esseri viventi e delle interazioni tra acidi nucleici e proteine (avviene un passaggio di informazioni). La tecnologia del DNA ricombinante fa uso di molecole biologiche studiate da questa disciplina. La genetica osserva i fenotipi e stabilisce le regole per la trasmissione delle caratteristiche ereditarie. La biochimica studia le molecole e individua le sostanze che vengono trasmesse. La biologia molecolare ha unito le due discipline.

Cellula procariote: cellula primitiva che contiene un miscuglio di DNA e proteine, è formata da una membrana fosfolipidica all’interno del quale c’è il cromosoma batterico (DNA circolare) e il citoplasma.

Cellula eucariote: struttura membranosa, le macromolecole sono compartimentalizzate, gli spazi sono delimitati da membrane, c’è una maggiore complessità cellulare e avvengono più reazioni. Nel nucleo è presente DNA. L’RNA viene trasferito dal nucleo al citoplasma, dove avviene la sintesi delle proteine e altre reazioni specifiche.

Gene eucariotico

Il DNA è grande, è diviso in cromosoma e la funzione dei cromosomi è quella di preservare il DNA. La funzione fondamentale del DNA è quella di contenere informazioni ed è un polimero relativamente semplice, formato da basi e da uno scheletro zucchero-fosfato. Gli acidi nucleici contengono le informazioni per costruire le proteine; per leggere queste informazioni si copia il DNA creando una molecola di RNA che, una volta letta dai ribosomi, darà poi origine alle proteine che sono polimeri complessi di amminoacidi. Non tutto il DNA è formato da geni, ci sono anche delle porzioni che, seppur convertite in RNA, non danno luogo alla formazione di proteine. Il gene non è un tutt’uno: ci sono le sequenze codificanti, gli esoni, e le sequenze non codificanti, gli introni. Gli introni devono essere eliminati dall’RNA. Un volta che tolgo gli introni dal RNA. Ottengo l’RNA maturo, che migra nel citoplasma per la sintesi delle proteine. Non tutti i geni sono trascritti. Genoma e DNA sono sinonimi; il genoma è l’insieme di tutti i geni presenti in un organismo vivente.

Il DNA contiene anche altre porzioni oltre ai geni. Queste porzioni non portano alla formazione di proteine ma sono comunque tradotte in porzioni di RNA che hanno importanti funzioni di regolazione. Il numero di geni per produrre le proteine è 24 000, numero molto piccolo rispetto a quello che si pensava inizialmente. Ci sono delle tecniche che codificano le sequenze degli esoni del gene, così riconosco le sequenze proteiche e posso prevedere farmaci o terapie in base alle caratteristiche genetiche. La trascrizione e la traduzione devono essere regolate e avere una certa direzionalità perché se leggessi in diverse direzioni avrei diversi messaggi finali. Gli acidi nucleici, sia RNA che DNA, sono sintetizzati in direzione 5’-3’, quindi qualsiasi polimerasi si muove in direzione 5’-3’. I due filamenti di DNA sono: il coding strand che ha la stessa sequenza nucleotidica del mRNA con differenza che al posto dell’uracile c’è la timina nel DNA e il secondo filamento che contiene la sequenza complementare.

Quando l’RNA è maturo viene portato fuori dal nucleo per sintetizzare le proteine. L’mRNA è letto in direzione 5’-3’ e la proteina ha direzionalità N-C. Entrambi i filamenti del DNA possono essere letti ma le due RNA polimerasi devono procedere in direzioni opposte.

Gene batterico

Nei batteri i geni sono già pronti a produrre le proteine. Nel batterio la traduzione può cominciare prima che finisca la trascrizione perché non c’è separazione tra nucleo e citoplasma. I geni batterici non hanno gli introni e quindi traduzione e trascrizione possono avvenire contemporaneamente. Gli enzimi di restrizione si trovano solo nei batteri. Quando incontrano una sequenza specifica essi tagliano la doppia elica del DNA del virus nello stesso punto o in punti sfalsati. Questi enzimi sono prodotti dal batterio per difendersi dai virus: gli enzimi legano il DNA del virus e non quello batterico perché quest’ultimo è metilato e quindi interrompe il pattern di relazione e impedisce all’enzima di legare il DNA.

Gli enzimi di restrizione sono enzimi batterici che rompono il DNA in maniera specifica; ogni enzima è in grado di riconoscere solo una specifica sequenza di nucleotidi. Se l’enzima incontra questa sequenza si unisce e forma un taglio netto. Questi enzimi tagliano il DNA con una precisione chirurgica anche se isolati. Il taglio provoca la rottura dello scheletro zucchero fosfato portando alla formazione di due catene.

Gli enzimi di restrizione sono prodotti dai batteri e tagliano il DNA.

La cristallografia a raggi X è una tecnica utile per studiare una proteina. Da una proteina pura è possibile ottenere dei cristalli in cui gli atomi sono disposti in maniera regolare nello spazio. Le onde dei raggi X possono essere deviati dagli atomi delle proteine cristallizzate; i raggi deviati formano una figura di diffrazione che permette di capire la disposizione degli atomi nella proteina.

Cronologia delle scoperte

1865: Mendel scopre la caratteristiche ereditarie genetiche

1869: Miescher scopre il DNA (nucleina) isolando degli acidi nucleici

1910: Morgan: teoria cromosomica dell’ereditarietà, analisi della ricombinazione e mappaggio dei cromosomi

1931: McClintock dimostrazione fisica della ricombinazione

1944: Avery scopre che il DNA è la molecola che contiene l’espressione genica

1953: Watson e Crick scoprono il modello a doppia elica che spiegava tutti i dati sperimentali, spiegava come il DNA potesse contenere così tante informazioni e come poteva essere replicato

Struttura del DNA

Il DNA è formato da due alfa eliche: nella parte esterna c’è lo scheletro zucchero-fosfato che è la parte polare, ricca di cariche e solubile in ambiente cellulare. Nella parte interna ci sono le basi azotate. La doppia elica è formata da uno scheletro zucchero-fosfato; le due eliche sono unite grazie all’appaiamento delle basi azotate che formano due o tre legami idrogeno. I legami idrogeno sono dei legami chimici molto deboli che permettono di unire due atomi sfruttando la polarizzazione; la presenza di più legami idrogeno fa sì che le forze si sommino tra loro facendo diventare maggiore la forza che unisce le due eliche. Questi legami non sono covalenti quindi la cellula è in grado, in determinate condizioni, di rompere il legame idrogeno separando le due eliche. La formazione di questi legami idrogeno avviene in maniera molto precisa: le basi si accoppiano come adenina-timina o citosina-guanina. Quindi le due catene hanno delle sequenze di nucleotidi che sono complementari tra loro.

Con una singola elica di DNA creo sia RNA complementare che il DNA complementare. La geometria tra le due eliche fa sì che lungo il DNA si formino solchi maggiori e solchi minori che dipendono dall’angolo tra la base e lo scheletro zucchero-fosfato. Questi solchi permettono l’interazione del DNA con le proteine che di solito si legano nel solco maggiore perché la proteina è voluminosa. Le proteine riconoscono e legano determinate sequenze di DNA in modo specifico: meccanismo che sta alla base delle regolazione genica. Questo modello spiega quindi sia come è possibile contenere molte informazioni (perché esistono numerose composizioni di nucleotidi) sia come è possibile replicare il DNA (perché avendo una sola catena se ne può creare un’altra complementare). I dati più importanti che portano alla formazione del modello a doppia elica sono dovuti agli studi effettuati con la cristallografia a raggi X, effettuati da Franklin e Wilkins, che permisero di scoprire la struttura tridimensionale. Nel 1962 Watson e Crick vinsero il premio Nobel per la medicina.

Tra il 1996 e il 2006 viene completato il sequenziamento del genoma umano: venne stabilita l’esatta sequenza di nucleotidi che compongono il DNA contenuto nei nostri cromosomi. Gene → RNA → proteina → funzione (enzima che catalizza una reazione o proteina strutturale). Gli scienziati pensavano che conoscendo l’intero genoma si potessero conoscere anche tutte le funzioni del nostro organismo svolte dalle proteine. Ciò non fu possibile perché non esiste una linearità così precisa tra gene e funzione perché una proteina per svolgere la sua funzione può essere regolata o modulata da altre proteine. Il numero di geni che codificano per una proteina è molto più piccolo di ciò che si immaginava, sono circa 23000 i geni che hanno una sequenza tale da codificare una proteina. Un’altra cosa che si pensava di ottenere in modo molto rapido conoscendo il genoma era uno sviluppo della medicina personalizzata.

Si pensava infatti che conoscendo il genoma di un individuo sano e di uno malato si potessero studiare le differenze e le mutazioni (nucleotidi diversi dal genoma sano). Nelle eventuali 200 mutazioni ce ne saranno alcune correlate alla patologia e studiando più individui malati riconosco delle mutazioni sempre presenti nei pazienti malati e mai presenti in quelli sani. Questo sarebbe relativamente facile se le mutazioni fossero 200 ma avendo un genoma formato da 3 * 10⁹ nucleotidi il numero di mutazioni possibili è pari circa a 10³-10⁴ e quindi per avere dei dati utili bisognerebbe studiare il genoma di 10³ individui malati e di 10³ individui sani.

Le diverse etnie condividono il 99,99% della sequenza nucleotidica: il concetto di “razza” non ha alcun senso dal punto di vista genetico. Essendo così tanti i geni anche solo lo 0,01% fa sì che ci siano molte diversità tra gli individui. L’analisi di queste varianti permette di stabilire le correlazioni tra gli individui. SNPs sono le varianti di un singolo nucleotide che possono ricadere all’interno di un gene che codifica una proteina o in una sequenza che però non è necessaria per costituire una proteina. Non si possono prendere in considerazione solo le mutazioni dei geni perché anche le mutazioni in una regione intergenica provocano delle differenze; anche queste regioni hanno un ruolo: queste magari producono delle molecole di RNA che interagiscono con l’mRNA di un altro gene interagendo con la produzione della proteina.

Il primo progetto di lettura del genoma umano ha richiesto uno studio di 10 anni; oggi, avendo una sequenza di riferimento del genoma umano e grazie ad un’evoluzione tecnologica, la completa sequenza del genoma umano si ottiene in un mese.

La chimica del DNA

Il DNA è un polimero di nucleotidi che sono formati da uno zucchero a 5 carboni (ribosio); in posizione 5’ sono uniti da uno a tre gruppi fosfato mentre in posizione 1’ sono unite le basi puriniche (adenina e guanina) o pirimidiniche (timina, citosina e uracile).

L’uracile ha le stesse proprietà della timina perché si appaia con l’adenina ma l’uracile è caratteristico del RNA. La presenza dell’uracile rende l’RNA molto più labile perché all’interno delle cellule ci sono molti enzimi che hanno il ruolo di degradare l’RNA e il DNA (l’RNA è più instabile del DNA perché a pH basico l’RNA si rompe ed è più facilmente eliminabile). Gli enzimi che degradano l’RNA sono gli RNAasi mentre quelli per il DNA sono gli DNAasi. Quando non è necessario avere una proteina viene bloccata la trascrizione e non si genera l’RNA; si blocca l’attività delle RNA polimerasi che non riconosce i promotori che permettono l’avvio della trascrizione. Dopo che ha svolto le sue funzioni la proteina viene degradata. L’RNA messaggero ha una durata di vita molto breve perché una volta avvenuta la trasmissione si degrada all’interno della cellula. Il DNA quindi è molto più stabile e non viene degradato, mentre l’RNA, una volta che ha svolto il suo ruolo, viene degradato.

I nucleotidi possono essere modificati prima di essere introdotti in una catena di DNA; per esempio l’ATP può subire una reazione dove si rompono i gruppi fosfato e si forma l’AMP ciclico grazie all’enzima adenilato ciclasi. L’AMP ciclico è un segnale, è una molecola importante per regolare la trascrizione genica. Se è presente poco glucosio viene attivato l’enzima adenilato ciclasi e quindi si produce molto AMP ciclica. Un’altra modificazione chimica frequente è la metilazione, cioè il legame di gruppi metilici ad alcuni atomi di carbonio. Solitamente si ha la metilazione al carbonio 5 della citosina; queste modificazioni servono sempre per regolare la trascrizione genica.

I nucleotidi possono essere modificati anche in vitro: vengono formati dei nucleotidi in cui, al posto dell’ossidrile in posizione 3’, si trova un idrogeno. Questi nucleotidi hanno permesso processi di sequenziamento. In alcuni casi un gruppo fosfato può essere sostituito da un isotopo del fosforo che rende il nucleotide radioattivo e quindi di conseguenza permette di ottenere un DNA radioattivo. Si possono sintetizzare anche nucleotidi in cui viene aggiunta la molecola biotina in quanto questa molecola è riconoscibile da alcuni anticorpi. Se metto questo nucleotide in un terreno di coltura possono codificare il DNA sfruttando degli anticorpi (tecniche immunologiche).

I nucleotidi polimerizzano formando la doppia elica; la reazione di polimerizzazione avviene tra l’ossidrile in posizione 3’ e il fosfato alfa del nucleotide successivo. La polimerizzazione essendo tra 5’ e 3’ avviene con una certa direzionalità. Il verso della polimerizzazione avviene sempre in verso 5’-3’. Le due catene di DNA sono antiparallele. Innalzando la temperatura le due catene si dividono tra loro, abbassando la temperatura si riuniscono secondo un appaiamento molto preciso. A 95° le due catene di DNA si dividono e rimangono come singole eliche all’interno di una soluzione acquosa; se aggiungo una molecola di ssDNA (molecola di DNA sintetizzata per via chimica e molto breve con una specifica sequenza) al DNA denaturato e riabbasso la temperatura, se in uno dei due DNA spaiati esiste una sequenza complementare all’oligonucleotide questo andrà ad unirsi li, anche se è una sequenza molto breve. Utilizzo quindi di una piccola molecola di DNA come sonda per trovare sul genoma umano il frammento complementare a quello che sto cercando. Per vedere la posizione della sonda utilizzo dei nucleotidi modificati e radioattivi.

Nella struttura del DNA i gruppi fosfati sono orientati verso l’esterno delle catene e stabilizzano la struttura perché sono acidi e quindi, in ambiente neutro, perdono un protone; essendo deprotonate queste catene esterne hanno carica negativa, sono polari e sono quindi solubili in acqua. Le basi azotate invece si trovano all’interno e per la formazione di legami idrogeno (che annullano la polarità) si va a creare un ambiente idrofobico. Questa idrofobicità è un ulteriore elemento che permette di mantenere unite le due catene per sfuggire alla polarità dell’acqua.

La doppia elica del DNA non è perfettamente simmetrica perché le due eliche sono leggermente sfasate. Il legame glicosidico che unisce i nucleotidi allo scheletro ha una certa angolazione. Si formano così un solco maggiore e un solco minore lungo l’elica del DNA. L’alternanza dei solchi maggiori e minori è importante per determinare l’avvicinamento di una proteina. Una proteina che interagisce con il DNA dovrà avere una struttura che sia compatibile con l’inserirsi in questi spazi del DNA.

La struttura del DNA esiste in tre forme: A, B, Z. Possiamo avere delle sequenze di DNA dove c’è una prevalenza di alcuni tipi di nucleotidi; queste sequenze possono assumere delle conformazioni diverse modificando la distanza tra solco maggiore e solco minore. Queste strutture possono favorire o sfavorire l’unione di una determinata proteina.

Quando appaiamo tra di loro i nucleotidi complementari non viene annullata del tutto la polarità di questi nucleotidi. Esistono comunque degli atomi che possono essere in grado di formare dei legami idrogeno in quanto conservano una certa polarità. A livello dei solchi maggiori e minori il pattern di possibili legami idrogeno è altamente specifico.

Proteine

• Sono polimeri ma ci sono legami consecutivi di amminoacidi, che sono venti. Gli amminoacidi sono molecole chirali; ogni amminoacido ha una configurazione L e una D ma tutti i sistemi viventi utilizzano la configurazione L.
• Ogni ammi