Biologia molecolare

STRUTTURA DEL DNA

Il mondo biologico è un intreccio di connessioni a diversi livelli di organizzazione. La biologia

molecolare si occupa di tutti i processi richiesti per il mantenimento e il passaggio

dell’informazione al fine di garantire la vita. Le molecole si raggruppano a formare cellule, a

loro volta interagiscono per formare tessuti. Più cellule si differenziano in modo simile e

quindi interagiscono tra di loro. Gli organismi formano poi popolazioni che fanno parte di

ecosistemi. Quindi il livello biologico è un intreccio di connessioni.

Un tema comune attraversa tutti i livelli di organizzazione: la comunicazione ed il continuo

passaggio di informazione da cellula a cellula, da organismo a organismo. Questa

informazione deve essere stabile e trasmessa alle generazioni successive.

Come viene mantenuta, utilizzata, creata?

La diversità della vita è unificata da alcuni temi comuni:

●​ Ogni organismo deve sere separato dall’ambiente che lo circonda. Esiste infatti una

membrana importante per tenere una concentrazione di molecole che consente di far

avvenire le reazioni.

●​ Ogni organismo deve essere in grado di mantenere l’informazione biologica in forma

stabile, e di utilizzare l’informazione per determinare le proprie caratteristiche di

composizione, struttura e funzionamento.

●​ Il genoma è in grado di tramandare le informazioni e creare un altro elemento simile

a se stesso e generare la vita

●​ Richiede una fonte di energia dall’ambiente circostante per crescere e riprodursi. Se

l’entropia si abbassa ho bisogno di un apporto di energia che prendo dal sole. Le

cellule sono in grado di assorbire energia direttamente come le cellule vegetali altri

indirettamente e sfruttano gli zuccheri generati dai vegetali.

Gli esseri viventi sono costituiti da componenti molecolari comuni: ci sono 4 classi principali

di molecole, acidi nucleici (mantenimento informazione energetica, proteine (funzionali),

lipidi ( parete cellulare) e carboidrati (energia, strutturale). Sono macromolecole costituite a

partire da unità più piccole ripetute. Proteine e nucleotide sono formati praticamente dagli

stessi atomi H, O, N, C, P, S. Le interazioni che fanno gli acidi nucleici sono fatte con gli

stessi atomi che esistono anche negli amminoacidi. Le proteine sono le macromolecole più

presenti nelle cellule, svolgono infatti molte funzioni. Poi lipidi, carboidrati, acidi nucleici.

Il flusso dell’informazione biologica contribuisce a garantisce il mantenimento della

vita.

È richiesto per garantire che la progenie di un organismo rimanga fedele ai propri genitori in

modo da trasmettere ciò che si è imparato ( dal punto di vista genetico) alla progenie.

Contenuta in un polimero, DNA acido desossiribonucleico. Acido perché contiene gruppi

fosfato: ha un ossigeno che dovrebbe essere OH, ma a Ph 7 l’idrogeno si stacca diventando

H+. La carica negativa dell’ossigeno la posso delocalizzare su due ossigeni che stabilizzano

il gruppo fosfato nella sua forma deionizzata. Comporta che il dna diventi acido, per ogni

nucleotide ci sarà una carica negativa, si comporta come un polianione. ( è formato da un

filamento lungo il quale ci sono tante cariche negative, quindi il dna è un polianione).

Ribonucleico perché la molecola è formata da nucleotidi costituiti da uno zucchero, il 1

dessoribosio e una base azotata. Il ribosio è nella forma deossi, non ha OH nella posizione

2’. La successione di basi azotate permette alla cellula di scrivere l’informazione.

La duplicazione dell’informazione contenuta nel dna è resa possibile da una semplice

corrispondenza di forma

Contenuta nella sequenza di basi. Permette inoltre la duplicazione del dna. Le basi del dna

sono complementari tra di loro. La sequenza può essere usata come stampo per sintetizzare

un nuovo filamento.

Il vantaggio è che con le stesse reazioni posso legare insieme più unità monomeriche,

imparando a fare una piccola reazione alla fine posso costruire molecole grandi con

filamenti, che formeranno strutture globulari che possono assumere funzioni. Un enzima è

un filo sottilissimo di amminoacidi che vengono costruiti grazie all’informazione contenuta del

dna. Il dna si chiama acido desossiribonucleotidi chiamato acido perchè grazie alla carica

negativa del fosfato. Formato da due filamenti complementari e antiparalleli, due perché se

io perdo ciò che è scritto su un filamento posso recuperarlo dall’altro, e perché

l’informazione è scritta in successione (successione di nucleotidi) che mi determina

l’informazione. I due filamenti sono legati da interazioni e quindi se ho una rottura i due

filamenti verranno aperti ma la struttura e la composizione sarà la stessa, perché legati da

tutto il resto. Danno minimo. Se la rottura avviene in coincidenza (come nel rna) non è

possibile rimediare. Inoltre noi siamo diploidi quindi abbiamo l’altra coppia del cromosoma

con uguale informazione. Quindi la doppia elica è meccanicamente e chimicamente più

stabile. Chimicamente perché l’informazione è resa possibile da una semplice

corrispondenza di forma. E l’informazione è protetta all’interno dell’elica. Inoltre con un

processo di duplicazione posso passare a una doppia elica a due coppie contenenti la

stessa informazione.

La scoperta del DNA

Nel 1928 griffino propone l’esistenza di un principio trasformante capace di trasformare un

ceppo batterico da non virulento a virulento. Utilizza due ceppi che determinano la

polmonite: R benigno e S virulento. Prende i batteri S li inietta nei topi e loro muoiono (niente

di nuovo).

Se prima però li inattiva si accorge che questi batteri

iniettati non funzionano e il batterio sopravvive come

se si iniettasse il ceppo R. Con la temperatura attorno

a 100 gradi i batteri muoiono: le proteine si

denaturano e abbiamo una perdita di membrana. Poi

prende dei batteri S inattivati e li mescola con batteri

del ceppo R, entrambi non dannosi per il topo: il topo

in questo caso muore.

Deduzione: visto che il calore uccide i batteri deve

esserci rimasto qualcosa che non si è danneggiato

con la temperatura che è in grado di cambiare il 2

fenotipo dei batteri R. Gli acidi nucleici sono più resistenti delle proteine e se li scaldiamo i

filamenti si separano, quando si ritorna a temperatura a norma i due filamenti si riuniscono

formando di nuovo la molecola di dna. Inoltre il dna è in grado di entrare in altre cellule. I

batteri R avranno quindi acquisito la caratteristica della capsula, cambiando fenotipo in

modo da diventare un batterio virulento ed è stato questo ad uccidere il topo. Si chiama

appunto principio trasformante perché è in grado di cambiare il fenotipo di un batterio.

Nel 1944 Avery annuncia che il principio trasformante è il DNA. Si sono affinate le

tecniche di separazione quindi lui rifà lo stesso esperimento però utilizzando gli elementi

separati, separo le proteine, gli acidi nucleici, lipidi. In queste provette venivano aggiunti dei

batteri R mettendoli a contatto. Quando usó la frazione contenuta il dna avviene la

trasformazione tra ceppo R a ceppo S. Avery quindi conclude che il principio trasformante è

l’acido nucleico dna e l’informazione che trasforma il ceppo è contenuta nel dna. L’attività

inoltre trasformante veniva persa quando venivano aggiunte desossiribonucleasi (degrada il

dna) mentre veniva mantenuta se la frazione purificata da ribonucleasi o enzimi proteolitici.

Nel 1952 l’esperimento di Hershey-Chase dimostrarono che solo la componente di

DNa del fango T2 trasporta l’informazione genica. I fagi sono composti da un involucro

proteico e da dna. Fecero uno dei primi esperimenti di biologia molecolare, marcarono in

modo selettivo le proteine e il dna. Volevano capire se l'informazione è contenuta nelle

proteine o nel dna. Gli acidi nucleici sono formati da H, O, C, N e P le proteine sono formate

da atomi di H, C, O, N, e S. Grazie agli isotopi radioattivi del fosforo (32) che distingue il dna

e l’isotopo radioattivo dello zolfo (35) contenuto solo nelle proteine, usati appunti come

marcatori per molecole biologiche. Se io faccio crescere dei fagi in un terreno con fosforo e

zolfo otterrò marcati con fosforo e zolfo. Lui mescola proteine marcate S35 e DNA marcato

P32 dei fagi con cellule di batteri. I fagi quindi si attaccano ai batteri e iniettano il loro

materiale genetico. Con un frullatore ottengo che i fagi si rompono andando poi a recuperarli

una volta che si sono duplicati del batteri. Ottengo dei fagi con radioattività del fosforo 32, in

quel dna fagico quindi ottengo delle porzioni di dna dei fagi utilizzati precedentemente. Con

questo esperimento tutta la comunità scientifica conclude che l’informazione genitiva è

contenuta nel dna. 3

Proprietà generali attese del materiale genetico

Capacità di immagazzinare informazione genetica e di trasmetterla alla cellula portatrice al

momento opportuno. L’informazione consiste nella sequenza di amminoacidi di una proteina,

di segnali di inizio e di terminazione, segnali regolativi. L’informazione è anche trasmessa

alla generazione successiva. Deve avere una stabilità chimica ma non assoluta. Perché la

capacità dell’informazione genetica di variare permette alle cellule di evolvere, permette di

modificare lentamente l’informazione genetica in modo che si possano selezione delle

proteine più efficienti e permettere l’evoluzione.

Proprietà chimico-fisiche del DNA già note prima della formulazione della struttura

della doppia elica da parte di Watson e Crick.

●​ Il DNA contiene nucleotidi legati tra di loro da ponti fosfodiestere, ho due ossigeno,

un fosfato e un carbonio.

●​ Campioni di DNA provenienti da specie diverse contengono le stesse basi

eterocicliche ma in quantità tra loro differenti e caratteristiche della specie. Grazie a

Chargaff, un chimico che analizzó diversi acidi nucleici di diversi organismi

studiandone la composizione. Alla fine pubblicò un articolo (1949) evidenziando che

tutti i genomi hanno una certa percentuale di basi azotate, ma facendo il rapporto tra

una concentrazione di timina e adenina, qualunque sia il rapporto risulta sempre 1 (lo

stesso per citosine e guanina). Quindi il numero delle adenina è uguale a quello delle

timina e viceversa. Quindi era vicino a capire che il DNA era fatto da basi

complementari.

●​ In tutte le specie di DNA, la stechiometria delle diverse basi eterocicliche è correlata:

​ A + G = C + T A = T e G = C (regola di Chargaff)

●​ Il DNA delle varie specie ha una certa viscosità e viene convertito in una forma a più

bassa viscosità (filamenti lunghi in soluzione la rendono viscosa) ad una

temperatura (Tm) caratteristica della specie. Dovuto al fatto che il dna si separa e

quindi la soluzione diventa più fluida. 4

●​ Più elevato è il contenuto in GC maggiore la ™, quindi separare i due filamenti.

●​ La fusione della doppia elica (melting) determina un aumento dell’assorbimento

spettroscopico a l=260 nm

●​ Alcune proprietà biologiche:

​ - DNA/RNA

​ - Ereditabilità

​ - Cromosomi

Determinazione della struttura chimica

Nel 1952 Rosalind Frankling ottenne PHOTO 51, cioè delle fibre molto ordinate e orientate

di DNA organizzate quasi a formare una struttura cristallina. Poi le metteva in un fascio di

raggi X per ottenere una diffrazione, su una lastra. Con delle trasformazioni matematiche è

stato possibile ottenere la possibile struttura. Ottenere delle macchie a croce.

Crick capì che la croce significava che il DNA aveva una forma a elica. La disposizione

di dna a seconda della forma che tiene cambia le forme. Posso con questa immagine capire

come sono disposti gli atomi all’interno del dna. Prende delle misure di questa elica: La

distanza tra le due macchie determina il passo dell’elica. Dall’angolo che misura sulla lastra

fotografica dice che l’elica avrà quell'angolo di inclinazione. Usa anche altri parametri:

distanza tra centro e macchia (trova la distanza tra le basi che compongono l’elica, è circa

3,4 A). Il periodo dell’elica (quanto spazio percorre in un giro) è 34 A. Quindi per ogni giro ci

sono circa 10 elementi, coppie di basi. L’elica è destrorsa.

Determinazione della struttura chimica del DNA

Lo spessore degli atomi che compongono le basi (C, O, N) è di circa 3,4 A per tutti dato che

sono nella stessa riga nella tavola periodica, quindi le basi sono attaccate le une alle altre

come mattoncini. La struttura della doppia elica non dipende solo dall'interazione dei ponti

idrogeno, molta dell’energia che tiene attaccata l’elica è dovuta a interazioni tra una base e

quella sopra. Tutti gli atomi quando sono messi vicini sono soggetti a una interazione 5

debole, interazione di Van der Waals, che prima è reattiva ma poi diventa repulsiva. Oltre il

raggio di Van der Waals (ingombro sterico) gli atomi diventano repulsivi.

I due filamenti hanno una polarità invertita, quindi solo antiparalleli.

Quindi il DNA è una molecola con due filamenti antiparalleli e complementari composti da

basi azotate dov’è la timina si accoppia con la adenina è la citosina con la guanina.

Forme tautomeriche delle basi

Le basi possono presentarsi con due forme: chetonica ed enolica. Il dna ha una certa

mutabilità, deve subire delle modificazioni, si dice che subiscono tautomerizzazione. Watson

e Crick pensavano che la guanina fosse in forma enolica, stessa cosa per la timina.

La guanina interagisce con la citosina con la faccia che favorisce i ponti idrogeni. Perché

avvenga l'interazione ho bisogno di un accettore e un

donatore. I due scienziati pensavano fosse in forma

enolica, quindi loro usavano questa struttura per fare gli

appaiamenti. Ma quando provavano a far rispettare la

regola di Chargaff non riuscivano a far appaiare le basi,

facevano solo un ponte idrogeno, interazione troppo

debole per costruire la struttura a doppia elica.

Capitò che nel loro studio accolsero uno studente, Jerry Donohue, che suggerì che sulla

base di un articolo la base più comune era quella chetonica. Così ho accettore e donatore

giusti in modo da creare tre ponti idrogeno nella coppia CG e due ponti idrogeno per la

coppia TA. Mi spiego così la regola di Chargaff, il fatto che se riscaldo la struttura si rompe.

Grazie a queste informazioni Watson e Crick furono in grado di costruire il modello

strutturale che descrive la struttura del DNA. Nel 1953 pubblicarono l’articolo più famoso del

secondo scorso, dove riportano i risultati e pubblicano il loro modello dell’elica di DNA. 6

Le basi hanno una complementarietà di forma e di carica, in modo da poter fare delle

interazioni elettriche. Interazione di carica si intende in questo caso un'interazione che non

necessita di un gruppo carico positivamente e negativamente, ma parziale. C’è una

dislocazione di cariche parziali abbastanza bilanciata di cariche ed è determinata dal fatto

che gli atomi hanno diverse elettronegativitá (N e O).

Cercheranno di attirare su di sé gli elettroni, con un a,tri l’atomo che ha una elettronegativitá

più bassa.

Interazioni non covalenti ed appaiamenti delle basi

Al carbonio uno troviamo la base e al carbonio 5 troviamo il gruppo fosfato. Considerazioni:

1.​ Possono essere purine o pirimidine (1 anello) foto numerazione

2.​ Sono eterociclici: troviamo anelli con diversi tipi di atomi, carbonio e azoto.

3.​ Troviamo doppi legami, quindi l'azoto e il carbonio sono ibridizzati sp2. Tutti gli atomi

dell’anello sono ibridizzazione sp2: ibridazione che genera tre legami covalenti sul

piano e l’orbitale pigreco sopra sotto il piano. Questo determina che le basi

eterocicliche sono molecole planari. Aspetto molto importante nell’impilamento delle

basi.

4.​ Il ribosio è ibridizzato sp3 e quindi non è una molecola planare e nella

determinazione della doppia elica sarà fondamentale.

Le purine sono adenina e guanina, le pirimidine invece sono uracile, citosina, timina. 7

Citosina e uracile

Sono simili ma il carbonio C4 ha una carica positiva. La citosina quando si trova in soluzione

acquosa va incontro a una reazione di ammirazione, sostituisce il gruppo NH2 con

l’ossigeno (entra acqua ed esce ammoniaca). L’acqua ha trasformato la citosina in uracile,

quindi un problema fondamentale per l’informazione.

Supponiamo che la vita si basi sull’RNA ( probabilmente il primo acido nucleico formatosi)

che contenga una sequenza ACUUGA. Che in una soluzione acquosa subisce una reazione

di amminazione spontanea diventa AUUUGA. Non ho modo di distinguere un uracile

sbagliato da uno giusto, perché sono esattamente uguali. Col tempo la sequenza perde le

citosine, di conseguenza perdo le guanine. Ovviamente questo non accade, perché?

Supponiamo di avere una sequenza: AUGCCAU. Se la citosina può subire una

deaminazione, contrassegno tutti gli uracile della sequenza. Se subisce la sequenza una

deaminazione allora sarà: AÜGUCAÜ.

Un sistema di riparo adesso sarebbe molto facilitato. Le cellule hanno trovato il modo di

rendere l'informazione più stabile, sostituendo l’uracile con la timina. Con la sostituzione

hanno marcato la uracile in modo che un eventuale di citosina producesse una molecola

simile. Il contrassegno usato per segnare l’uracile è il CH3, poi verrà sostituito con la timina.

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Infatti se nel dna trovo l’uracile vuol dire che una citosina è stata deamminata e quindi posso

sostituirla. Questa è una delle modificazioni che il dna può subire.

Il deossiribosio lo possiamo chiamare 2deossiribosio. Il fatto che nel