Biologia molecolare

Biologia molecolare

I caratteri che noi vediamo (es: colore occhi), sono determinati da dei geni, che sono costituiti dal DNA. (fenotipo)

Alcuni vengono ereditati dai nostri genitori.

Mentre l’info genetica chiamata genotipo è formata dalla collezione di geni.

Delle volte un carattere è determinato da un gene, e questa informazione viene trasmessa dal genitore al figlio/a, grazie al DNA.

Mendel è stato tra i primi a dimostrare che c’erano dei caratteri trasmessi da generazione a generazione.

Mendel ha cercato di semplificare il problema, e nel tentativo di farlo, ha studiato varietà di piante che producevano dei piselli, ma un solo tipo di seme di pisello (rugoso) e lo chiamava rr, e studiava altre piante che producevano un altro tipo di seme di pisello (liscio), chiamandole RR.

Incrociandole, otteneva una situazione eterogenea, quindi dei semi rugosi e lisci (Rr). La situazione non era però 50/50. Alcuni caratteri sono dominanti e altri recessivi. Vengono trasmessi due caratteri da questa combinazione, in un seme non abbiamo un carattere R ma due caratteri RR (informazione seme liscio) idem nel rugoso rr.

Questa cambia nel gamete che si divide in due e divide le due informazioni, poi ricombinati con il gene materno nella cellula fecondata. Rapporto 3:1.

Omozigoti = due caratteri uguali; Eterozigoti: due caratteri diversi.

Il genotipo è eterozigote, ma noi fenotipicamente lo vediamo come seme liscio RR perché è dominante.

I nostri genitori trasferiscono ai figli le informazioni, che hanno la forma di DNA che contiene i geni, passaggio tramite il principio di conservazione.

Trasformazione

Griffith studiava i batteri, che avevano una capacità di indurre malattia nei topi, e, quest’ultimo moriva (S). Quindi questo batterio aveva un carattere che portava alla malattia.

Griffith aveva altri batteri che chiamava per (R) dove il topo però non moriva, poiché il batterio, sempre streptococco, non aveva il gene della polmonite.

Griffith, quindi, prendeva il batterio S, lo decomponeva, poi, lo prendeva e lo iniettava ai topi, che, non morivano. Questo per dire che ha bisogno di una cellula viva per infettare.

Ha preso il batterio S e lo ha inattivato, e lo mescolava al batterio R attivo.

Il batterio R quando inoculato nel topolino, moriva.

Questo per dire che il materiale biologico, di per sé inattivo, era in grado di trasferirsi nel batterio R, e acquisire il carattere del S per uccidere il topolino.

Tutto dato del DNA, poiché le proteine denaturano con il calore, il DNA no.

DNAsi = degrada il DNA (no effetto proteasi). = no malattia

DNA: materiale genetico dei virus

Il virus batterico è formato di proteine, con al suo interno una molecola di DNA.

Quando infetta, inietta il suo DNA batterico dentro.

Acidi nucleici

È una molecola polimerica (più monomeri), è formato da nucleotidi con una direzione. Sono polimeri lineari (no ramificata). Sono uniti da stessi legami.

DNA (acido deossiribonucleico)

RNA (acido ribonucleico)

Nucleotidi: zucchero; base azotata (legata al C1) e gruppo fosfato (legata al C5)

Purine = se sono grandi (due anelli fusi); Pirimidine = sono piccoli con un anello fuso. Sono basi azotate perché contengono parecchi atomi di azoto, che, in un ambiente acquoso sono basici.

Il gruppo fosfato invece, è formato da un atomo di fosforo, che lega 4 atomi di ossigeno.

Nucleoside = formata da zucchero e base azotata; Nucleotide = zucchero, base azotate + gruppo fosfato.

Il legame che lega due nucleotidi è chiamato fosfodiestere.

Struttura DNA

L’ossatura del DNA è dato da gruppo fosfato e deossiribosio, le basi azotate all’interno, uniti da ponti idrogeno che si stabiliscono tra le basi azotate e rendono la molecola stabile.

Le basi azotate si associano sempre pirimidine con purine, perché il diametro della molecola deve essere costante.

Regole di Erwin Chargaff

• Nel DNA le quantità delle basi G è sempre uguale a quella di C e la quantità di A è sempre uguale a quella di T (su filamenti opposti)
• La quantità delle basi puriniche è uguale a quella delle basi pirimidiniche.
• La composizione in basi del DNA, definita come percentuale G+C differisce nelle varie specie (dal 22 al 73%) ma è costante in tutte le cellule di un organismo. Cambia la sequenza delle basi azotate, strutturalmente sono uguali.

Filamento di DNA ha due filamenti, con molecole separate. Filamenti antiparalleli con diametro molecola costante (2 nm). Sono necessari 10,5 BP (best pair = paia di basi). Indipendente dal numero dei nucleotidi, la molecola ha la stessa conformazione tridimensionale.

Solco maggiore = si legano le proteine al DNA

Solco minore = le proteine fanno più fatica ad entrare.

Il DNA può subire variazione.

Il DNA ha un’informazione e le proteine si legano allo stesso, viene prodotta una molecola di RNA messaggero.

Conformazione A o Z: molecola più compatta. Quindi cambia anche l’informazione (geni) che va a mandare e regolare la sua funzione. No proteine = no informazione. DNA non accessibili e i cassetti (info) rimangono chiusi. Quindi la struttura è fondamentale per l’informazione trasmessa.

Fattori trascrizionali = guidano i geni alla trascrizione genica

Inter-molecolare = legame tra due molecole diverse che sono tenute insieme dal legame delle basi azotate.

Ci sono anche delle strutture ad anse, con interazione intra-molecolare (stesso filamento).

Le sequenze devono essere uguali per avere un legame forte per formare questa ansa.

Ruoli delle basi azotate

Legati tra di loro tra ponti idrogeno. La perfetta complementarità tiene insieme i due elementi.

Il DNA codifica le informazioni. Le basi azotate fungono da codice genetico.

La sequenza è il susseguirsi uno dietro l’altra specifici nucleotidi. La struttura rimane la stessa.

Cromatina

Una cellula media ha diametro 10-100 micron.

Diametro nucleo: 6 micron

Filamento DNA nelle cellule: 2 m

La molecola non è allungata, ma è arrotolata intorno alle proteine, e questo permette di compattare la struttura del DNA all’interno del nucleo.

DNA sempre associato a proteine istoniche. La cromatina è data l’associazione del DNA con le proteine.

Istone formato da 8 proteine uguali (H1A, H2B, H3B, H4B), in più abbiamo una molecola di DNA che si avvolge all’istone, ruotandogli intorno, fuoriuscendo.

L’istone H1 sta in posizione periferica e determina se i vari istoni devono stare vicini.

Le proteine istoniche durante il processo evolutivo non sono cambiate, perché un loro mutamento, provoca la morte della cellula, poiché l’istone stabilizza il DNA.

La proteina è carica positivamente perché ha amminoacidi basici.

Il DNA si lega all’istone perché l’ossatura del DNA ha tante cariche negative, che ha forte associazione con l’istone.

Ogni nucleosoma (proteine istoniche + DNA) ha un H1.

Gli istoni H1 determinano l’interazione di altri nucleosomi e compattamento di fibre.

Cromosomi

Il cromosoma 1 è quello più grande, e man mano si va avanti diminuiscono.

Nel cromosoma ci sono due filamenti di DNA e le proteine istoniche e non istoniche.

Il cromosoma 2 ha sempre la stessa conformazione ma più piccola. Cambia solo la dimensione.

Siamo esseri diploidi, con due copie di cromosoma, uno materno e uno paterno.

Nella fase G1 abbiamo 23x2 cromosomi. Le bande chiare e scure, indicano delle regioni più condensate (eterocromatina, non permette alle proteine di legarsi) e meno condensate (eucromatina).

La cellula può cambiare alcune caratteristiche, non comprendendo la replicazione del DNA.

Fase S: sintesi del DNA (replicazione del DNA). 23x2x2

Due molecole di DNA duplicato ma sempre 1 materno e poi uno paterno, tenute insieme dal centromero.

Fase G2: una cellula con quantitativo doppio di DNA si divide in due.

Fase M: divisione cellulare

Avremo due cellule figlie che si dividono, il cromosoma 1 materno, andrà a dividersi in due, la stessa cosa con il cromosoma 1 paterno, non sono legati, ma divisi.

Telomero: funzione di protezione

Centromero:

Il genoma degli organelli

Mitocondri responsabili principali dell’adattamento aerobico.

Responsabili fosforilazione ossidativa: produzione ATP

Sede respirazione cellulare.

DNA interno al mitocondrio, con il suo genoma. (no altri organelli)

DNA non lineare (circolare) genomico ed extra nucleare (nel mitocondrio)

Nel mitocondrio abbiamo più copie del genoma mitocondriale.

1 gene = 1 unità di informazione = 1 sequenza

1 gene codifica per un mRNA. Trascrizione su molecola diversa con sequenza uguale, con uracile al posto di timina e ribosio al posto del deossiribosio. Dopo la trascrizione, l’mRNA può essere tradotta in una proteina. (principio generale biologia molecolare).

Le proteine vengono sintetizzate nel citosol nei ribosomi, ed entrano nel mitocondrio. L’attività deve essere coordinata e sinergica tra i cromosomi nucleari e mitocondriali, soprattutto con esercizio fisico aerobico.

Al mitocondrio il suo genoma non basta per produrre altri mitocondri.

Se subisce una mutazione, il mitocondrio non muore perché ha più copie di genoma.

La molecola del DNA nucleare invece, non è coperta tutta di geni, come il DNA mitocondriale.

Valore C: quantità totale del DNA presente in un genoma

Paradosso C: discrepanza tra grandezza del genoma e complessità genetica.

Genoma: insieme di tutti i geni di un organismo delle sequenze intergeniche

Gene: informazione genetica per la sintesi finale di un RNA o di una proteina

Una certa sequenza di DNA può duplicarsi. Può avere una mutazione negativa e il gene muore ma senza essere letale per l’organismo. Se la mutazione è positiva, ho più probabilità di fitness.

Processo di replicazione

La cellula muscolare non replica continuamente, come il neurone. A differenza della pelle.

Le cellule satelliti stanno in G0, quindi sono in quiescenza (attive ma ferme).

Sono però recettive (che stanno attente a capire cosa succede al tessuto muscolare), e, possono attivarsi (G0 G1 e iniziare il ciclo cellulare).

Quando una fibra subisce un DAMPS (segnali che identificano micro traumi nella fibra muscolare, con fuoriuscita di molecole). Questi DAMPS attivano processi di infiammazione.

Rilascio DAMPS da G0 a G1 (satelliti) inizio sintesi proteica (mioblasti) = cellule satellite attivate. Quest’ultime iniziano il ciclo cellulare.

Proliferazione cellulare controllata

Una volta nel nucleo (proliferazione) il processo procederà in maniera asimmetrica. Avremo alcune cellule che andranno in quiescenza e altre che andranno a differenziarsi (differenziamento miogenico).

Le cellule che passano da mioblasto a quiescenza, sono le cellule che torneranno sulla lamina basale, dormienti.

Differenziamento miogenico: quei processi in cui le cellule si fondono con una fibra pre-esistente, con riparo della fibra muscolare.

Formazione di nuove fibre invece, le cellule satellite si fondono per crearne di nuove.

In sintesi, da una cellula dormiente, ne avremo tante attive (risultato proliferazione). Quando iniziano ad accumularsi, escono dal ciclo cellulare (non proliferano più), e subiscono un processo di differenziamento asimmetrico.

Il processo comprende il 10% dell’ipertrofia. L’accrescimento del muscolo è dato dalla sintesi proteica, le satelliti invece processi di riparo.

Nel differenziamento miogenico, la fusione può essere tra mioblasti o tra una fibrocellula preesistente. Costituendo una cellula muscolare immatura e poi matura.

Questo processo mostra un differenziamento, ovvero, che prima, una cellula dormiente, in seguito del differenziamento, andrà fenotipicamente cambiando.

Le cellule embrionali, sono il massimo livello di cellule staminali, che possono differenziarsi in qualsiasi nostro tessuto (medicina rigenerativa).

Differenza cellule embrionali, staminali e adulte

Le cellule staminali embrionali, si chiamano totipotenti/pluripotenti, le cellule staminali adulte sono indirizzate/determinate. Ovvero, cambia la varietà di cellule in cui può differenziarsi.

Attenzione però, che nella differenziazione, il tessuto muscolare può essere sostituito da tessuto fibrotico o adiposo. Per poter funzionare bene, le cellule satellite devono avere capacità di differenziamento.

Pull di cellule satellite: numero limitato di cellule satellite (non sono infinite!)

Durante l’invecchiamento, il processo di quiescenza viene sempre meno, diminuendo il pull delle cellule satelliti.

La replicazione del DNA è un processo semiconservativo (passiamo da una molecola di DNA madre, a due di DNA figlie). Le due molecole sono formate da filamenti vecchi e nuovi.

Succede che i ponti idrogeno vengono spezzati, e di conseguenza la molecola viene separata.

A questo punto inizia il processo di sintesi del DNA. Deve garantire il mantenimento dell’informazione (sequenze identiche!). Come lo fa? Copiando il filamento stampo (vecchio e originale). La molecola prodotta sarà semiconservativa. Sempre 5’ → 3’.

Il principio generale, è, che il filamento sintetizzato, viene costruito copiando il filamento originale.

Gli enzimi che polimerizzano i nucleotidi in un filamento di DNA in crescita sono chiamati DNA polimerasi. Negli ultimi anni, il numero di DNA polimerasi note sia nei procarioti che negli eucarioti è cresciuto enormemente. Negli eucarioti, tre diverse DNA polimerasi sono coinvolte nella replicazione del DNA cromosomico: la DNA polimerasi α, la DNA polimerasi δ e la DNA polimerasi ε. La DNA polimerasi γ è utilizzata esclusivamente per la replicazione del DNA mitocondriale (mtDNA). Questi quattro enzimi sono chiamati polimerasi replicative, per distinguerli dalle restanti polimerasi coinvolte nei processi di riparazione.

Tutte le DNA polimerasi conosciute possono aggiungere nucleotidi solo nella direzione 5' → 3'. In altre parole, una DNA polimerasi può catalizzare la formazione di un legame fosfodiesterico tra il primo gruppo fosfato 5' di un nuovo dNTP e il gruppo idrossilico 3' dell'ultimo nucleotide nel filamento appena sintetizzato.

Tuttavia, le DNA polimerasi non possono agire nell'orientamento opposto per creare un legame fosfodiesterico con il 5'-fosfato di un nucleotide già presente nel DNA e il 3'-idrossile di un nuovo dNTP. Un'altra caratteristica delle DNA polimerasi è che non possono avviare la sintesi del DNA de novo (dal latino "dall'inizio"). Ad eccezione della DNA polimerasi α (la polimerasi coinvolta nella sintesi dei primer, PRIMASE), tutte richiedono un "primer". Il primer è solitamente una breve catena di RNA (forma primi nucleotidi) che deve essere sintetizzata sullo stampo di DNA prima che la DNA polimerasi possa iniziare l'allungamento di una nuova catena di DNA (i primer sono discussi in dettaglio di seguito).

Solo dopo aver avuto il primer, le polimerasi δ e ε possono iniziare il loro compito.

Il primo processo si chiama “dissociazione dei due filamenti”, struttura parallela che prende il nome di “bolla di replicazione”. Questo processo è assicurato dalle elicasi (aprono l’elica del DNA). Una volta aperto, i filamenti sono delicati alle rotture (non lo vogliamo!), e quindi intervengono delle proteine, le Single Strand Binding Protein, che si legano al filamento unico del DNA, stabilizzandolo. Ora possono intervenire le DNA polimerasi, iniziando il processo di sintesi del nuovo filamento.

Gli enzimi che intervengono per primi nella sintesi sono: la DNA polimerasi α (filamento innesco, inizia a mettere alcuni nucleotidi, polimerasica 5’ → 3’). Il primo filamento è il primer (dai 20 ai 50 nucleotidi), dato da RNA. Qui interviene la DNA polimerasi δ (leader, ha anche un'attività, oltre ad aggiungere in 5’ polimerasica, ma può aggiungere anche in 3’ → 3’ → 5’ esonucleasica, e anche un'attività esonucleasica 5’ e può tagliare il filamento di DNA partendo da 3’ e si muove verso 5’ e viceversa.) o ε (ritardato), che allunga il filamento di DNA dato dal primer. Da qui si va avanti di DNA, il primer dato da RNA è solo nelle prime sequenze. Filamento leading sintetizzato in maniera continuativa.

Sul filamento opposto, ci vorrà sempre il primer, che però sintetizza in maniera opposta, quindi ma la DNA polimerasi sintetizza in maniera opposta (→). Questo meccanismo avviene con una crescita a gambero, attraverso i frammenti di Okazaki.

La molecola del DNA può essere replicata in poche ore, grazie a tante origini (siti da dove inizia la replicazione si possono formare più anse con proteine che legano).

Queste proteine poi sono responsabili dell’apertura della molecola del DNA (formazione di bolla di replicazione). Le elicasi nel mentre sono responsabili dell’apertura del filamento di DNA. A quel punto si legheranno altre proteine (single strand binding protein) e verranno richiamate le DNA polimerasi, che si legheranno alle due estremità. Il macchinario della replicazione poi si muoverà in maniera bidirezionale.

Quando i due macchinari (tante proteine) si incontrano in maniera bidirezionale, si stacca perché la replicazione è completata.

La bolla di replicazione va divisa in due parti perché i macchinari si muovono in due direzioni diverse. Sul filamento c’è la DNA polimerasi che sintetizza il filamento con le basi azotate.

Il filamento s