Biologia molecolare

Biologia molecolare

Luca Mennella

Date: September 12, 2023

University of Trento

Biomolecular Science and Technology

Via Sommarive 9, 38123 Povo (TN), Italy

Capitolo 1: Struttura e funzione dei cromosomi

1.1 Ricerca del materiale genetico

Prima che Watson e Crick risolvessero la struttura del DNA nel 1952, cosa si conosceva dei geni e del DNA?

Prima del 1950, si riteneva che fossero le proteine i trasportatori delle informazioni genetiche.

Nel 1719 Anthony van Leeuwenhoek identificò, attraverso un microscopio (strumento costituito da lenti con uno zoom di 270x), e disegnò dei nuclei nelle cellule del sangue rosso di salmone.

All’interno della globulina rossa vi era una densità diversa che lui chiamava seed, ovvero il nucleo.

Nel 1865, Gregor Mendel, un frate e matematico cecoslovacco, ha mostrato che i geni (Merkalen) trasmettono informazioni genetiche. Questo rivela la trasmissione fenotipica di caratteristiche ereditarie. Mendel rimuoveva gli stami dai fiori viola e trasferiva il polline dagli stami dei fiori bianchi per depositarli sui carpelli dei fiori viola. I carpelli maturi impollinati maturarono in baccelli e a partire dai semi che furono piantati, si originarono piante con caratteristiche osservabili e confrontabili.

Nel 1868, lo studente di medicina svizzero Freidrich Miescher prese le garze impregnate di pus (globuline bianche del sangue che si formano con le ferite) e da esse isolò i nuclei: all’interno di essi era presente una sostanza isolabile chiamata nucleina, che era ricca di fosfato. In ciascun di questo elemento non è presente nessun gruppo solfidrico.

Nucleina: sostanza che si estrasse dai nuclei di globuli bianchi.

Nel 1885-1901, il chimico Albrech Kossel analizzò la nucleina e scoprì che essa conteneva: fosfato, zuccheri, citosina, timina, adenina, guanina e uracile (anche se nel DNA non è contenuto uracile). Aveva già capito che le basi azotate presentavano delle similarità, per esempio la presenza di un gruppo metile.

Nel 1929, Phoebus Levene caratterizzò più nel dettaglio lo zucchero contenuto nella nucleina: due desossiribosi, da cui derivò il nome acido desossiribonucleico. Capì l’esistenza di due acidi nucleici:

• Acido desossiribonucleico
• Acido ribonucleico (che ha come zucchero il ribosio)

Inoltre, comprese che il DNA fosse un tetranucleotide ciclico, in cui le basi azotate sono legate tra loro con legami esteri. Tutte le componenti erano a conoscenza, tuttavia non si era ancora compresa la loro funzione.

Nucleotide: nucleoside + fosforo

Nucleoside: base azotata + zucchero

Nel 1928, Frederick Griffith voleva sviluppare un vaccino contro la polmonite (causata da Streptococcus pneumoniae) nei topi. Egli usò due tipi di Streptococcus pneumoniae:

• Rough (R): non virulento perché non coperto da un capside polisaccaridico;
• Smooth (S): coperto da una capsula polisaccaridica che protegge il batterio dal sistema immunitario del topo, perciò è altamente virulento.

Le cellule R potevano essere trasformate in cellule S: inserendo le cellule S, uccise con il calore, nel topo, quest’ultimo viveva. Inserendo nel topo, invece, cellule R vive e cellule S uccise con il calore (quindi mescolate), l’animale moriva. Quello che è successo è che le cellule R si sono trasformate, ovvero hanno acquisito frammenti di DNA delle cellule S che codificano per le componenti della capsula e perciò hanno acquisito questa capacità. Per verificare questo, è stato estratto il sangue del topo e si è osservato che erano presenti cellule S vive.

Dopo 5 anni di lavoro necessari per frazionare le cellule morte (separando le varie componenti per centrifugazione e poi distruzione di tali componenti nei loro costituenti), si è scoperto che il topo sopravviveva quando il DNA delle cellule S era distrutto. Quindi, si è compreso che il DNA era il fattore determinante per la trasformazione delle cellule.

Questo “agente trasformante” cambiò il genotipo del recipiente e per questo era un candidato per essere il materiale ereditabile. Nonostante ciò, le proteine erano ancora ritenute essere l’informazione genetica. Nel 1944, dopo 15 anni di lavoro da parte di Griffith, basandosi sulle sue osservazioni Avery, MacLeod e McCarty identificarono che l’agente trasformante era il DNA.

Nonostante i convincenti esperimenti da parte di Avery e i suoi colleghi, molti scienziati non accettarono che il DNA, piuttosto che le proteine, fosse il materiale genetico. Dopotutto, come poteva una semplice molecola incorporare la diversità di tutti gli esseri viventi?

Nel 1952, Alfred Hershey e Martha Chase fornirono prove che il DNA fosse il materiale genetico usato da batteriofagi T2, un DNA di virus che infetta i batteri.

Hanno ragionato che il fago, quando infetta un batterio, deve iniettare la sua informazione genetica che porta alla produzione di virus della progenie. Se avessero potuto determinare quale materiale inietta il fago, avrebbero identificato il materiale genetico dei fagi (e probabilmente anche di tutti gli organismi).

Hershey osservò fagi con DNA marcato con ³²P e virus con corpi marcati con ³⁵S.

Hanno mescolato questi fagi con una coltura fresca di E. coli: nel primo esperimento in cui si è usato il fago con DNA marcato ³²P, il virus si staccava dalle cellule di batterio con una “frullata” e con una centrifugazione si osservò che il pellet conteneva alta radioattività, mentre il surnatante ne mostrava poca. Questo vuol dire che il DNA dei fagi è entrato nelle cellule dell’organismo.

Nel secondo esperimento si osserva il risultato contrario: il pellet presenta bassa radioattività, mentre il surnatante un’alta radioattività. Questo perché era il corpo ad essere marcato.

Nel primo esperimento batteri di Escherichia coli sono stati mescolati a fagi marcati radioattivamente con ³²P. Dopo aver aspettato 10 minuti in modo che i fagi infettassero le cellule e inserissero il loro DNA nell’ospite, il miscuglio è stato sottoposto a forze di taglio nel frullatore per separare i fagi dalle cellule. Successivamente il tutto è stato sottoposto a centrifuga e si è osservato che il surnatante contenente i fagi era leggermente radioattivo, mentre il pellet contenente le cellule era altamente radioattivo.

Nel secondo esperimento sono state svolte le stesse procedure ma il risultato è differente: il surnatante è radioattivo, mentre il pellet solo leggermente. Questo dimostra che è il DNA ad essere il materiale genetico che contiene l’informazione ereditaria per la replicazione.

Prova che l’RNA trasporta l’informazione genetica in alcuni virus

Nel 1957, il polacco Heinz Fraenkel-Conrat usò il virus del mosaico del tabacco (TMV), un piccolo virus che presenta nella testa singoli filamenti di RNA incapsulati in un mantello proteico.

Ci sono vari ceppi di mosaico del tabacco che hanno una differente composizione del mantello proteico. Egli utilizzò due gruppi A e B di virus che vennero trattati con sostanze chimiche (proteasi) che dissociavano il mantello. In questo modo le proteine vennero separate dai corrispettivi filamenti di RNA.

Le proteine che provenivano da un ceppo vennero mischiate con l’RNA proveniente dall’altro, risultando nei virus infettivi composti dalla capsula proteica di un ceppo e l’RNA dell’altro. Questo virus ibrido infettò la pianta del monaco e si vedeva che il virus che usciva era quello che presentava l’RNA del gruppo A e le proteine del gruppo B, perciò un virus con caratteristiche costituenti miste.

I virus progenie che lasceranno le foglie del tabacco, quando infettate, saranno geneticamente identici al filamento parentale da cui l’RNA è stato ottenuto. Questo dimostrò che l’informazione genetica del virus del mosaico del tabacco era contenuta nell’RNA e non nelle proteine (capside).

Dopo la dimostrazione della natura genetica dell’RNA nel TMV, RNA venne trovato in altri batteriofagi. Perciò, si può concludere che gli acidi nucleici in generale, RNA così come DNA, trasportano l’informazione genetica. Forse il DNA funziona sempre come il principale materiale genetico; l’RNA svolge la stessa funzione in sistemi in cui il DNA è assente.

1.2 La struttura del DNA

Prima che la struttura del DNA venisse scoperta, studi genetici indicarono che il materiale ereditario dovesse avere 3 proprietà:

• Siccome ogni cellula del corpo di un organismo ha la stessa composizione genetica, le caratteristiche strutturali del materiale genetico dovrebbero permettere un’accurata replicazione;
• Siccome deve codificare le proteine espresse da un organismo, le caratteristiche strutturali del materiale genetico dovrebbero racchiudere un contenuto informazionale;
• Siccome cambiamenti ereditari, chiamati mutazioni, forniscono la materia prima per la selezione evolutiva, il materiale genetico dovrebbe essere in grado di cambiare in rare occasioni.

Nel 1950, l’americano Erwin Chargaff analizzò la composizione di DNA provenienti da diversi organismi e notò che alcuni elementi, le basi azotate, si ripetevano. Suggerì che T+A, così come C+G, erano presenti in relazione costante.

Nel 1952-53 ci furono gli studi sulla diffrazione a raggi X del DNA. Quando i raggi X sono focalizzati su una molecola purificata, essi sono deviati dagli atomi delle molecole in specifici modelli di diffrazione, che forniscono informazioni riguardo l’organizzazione molecolare della molecola. Questi modelli di diffrazione dei raggi X potevano essere registrati su una pellicola sensibile ai raggi X.

Tre scienziati hanno provato a dimostrare a livello sperimentale la struttura del DNA: Linus Pauling, Maurice Wilkins e Rosalind Franklin. Watson e Crick hanno solo creato un modello sulla base dei dati sperimentali di questi tre scienziati, ma non hanno mai svolto alcun esperimento, in particolare hanno sfruttato il lavoro di Rosalind Franklin, la quale avrebbe potuto vincere due Nobel: uno per il DNA e l’altro per la caratterizzazione di un virus. Linus Pauling si basava su esperimenti di bassa qualità: ha suggerito la struttura del DNA avendo dei dati di poca qualità.

Quando si parla di analisi della diffrazione dei raggi X, si parla di cristallografia.

Si usano dei cristalli, ovvero molecole super concentrate e pulite (precipitate in una forma stabile). Dato che all’interno di una molecola gli atomi sono distanti circa 0.1 nm (1 Armstrong), i raggi X sono gli ideali per poterli analizzare dato che hanno una lunghezza d’onda della stessa dimensione. Questo permette di discriminare i dettagli a livello atomico.

Il DNA non è cristallizzabile perché è una struttura lunga e polisaccaridica. La cristallografia di solito si usa con le proteine.

I raggi X incontrano gli atomi della proteina, che è in forma di cristallo. Nella struttura della proteina ogni atomo ha un peso diverso e un numero di elettroni differente. Un atomo con pochi elettroni non si fa vedere molto. I raggi X si diffrangono e rimbalzano sui singoli atomi (per via degli elettroni), provocando il fenomeno di diffrazione. Questi raggi riemessi vengono registrati su una pellicola producendo uno schema di macchie scure, ovvero i riflessi. A partire da questo schema, vengono misurate la distanza e l’angolo del centro dell’immagine rispetto a ciascun riflesso. Le trasformazioni di Fourier convertono queste misurazioni in una struttura atomica.

Visto che il DNA lungo non è cristallizzabile (mentre i frammenti si possono cristallizzare), un campione di DNA viene steso e collegato ad un peso (tappo di sughero) per tendere il campione e permettere di essere colpito dai raggi.

Nella camera del cristallo si può creare dell’umidità, che è molto importante: Rosalind Franklin ha usato un’umidità molto alta che ricrea le condizioni in cui il DNA si trova all’interno del nucleo. In condizioni di poca umidità, la struttura del DNA si arrotolava in maniera diversa dalla realtà.

• Materiale non cristallizzabile (DNA): scattering
• Materiale cristallizzabile: diffrazione

Nella foto 51 (le altre 50 erano fallite perché il segnale era basso) si osservano i raggi X diffratti del DNA proveniente dal timo di vitello. Il filamento di DNA è stato allungato attraverso una graffetta e montato su un tappo di sughero. I raggi X sono stati mandati attraverso il filamento di DNA e i loro modelli diffratti sono stati catturati su un foglio sensibile creando la foto 51.

Il DNA contiene carbonio, ossigeno, fosforo e idrogeno. Gli atomi di idrogeno non si diffrangono quasi per nulla, mentre gli atomi di carbonio, azoto e ossigeno diffrangono maggiormente i raggi X. Il fosforo si disperde quattro volte di più. Il modello ottenuto nella foto 51 è molto simile a quello delle α-eliche presente nel modello delle proteine, la cui struttura era già stata studiata.

Tutti i segnali neri che si vedono sono il fosforo poiché esso contiene 15 elettroni. La “X” al centro della foto 51, che ha una forma molto simmetrica, è causata dalla forma ad elica delle molecole di DNA nel campione. I segnali che vengono identificati sono quelli del fosforo e analizzando i dati si riesce a identificare le eliche. Tra i segnali si possono misurare le distanze: tra un segnale ed un altro vi sono 3.4 Armstrong.

Nel 1953, lo statunitense James Watson e l’inglese Francis Crick crearono un modello in metallo della struttura del DNA in 3D e in 2D tenendo conto dei dati della diffrazione dei raggi X ottenuti da Wilkins e Franklin. Questi dati indicarono che il DNA era altamente ordinato, a forma di elica, con una struttura a doppio filamento e sottostrutture che si ripetevano ogni 0.34 nanometri lungo l’asse della molecola. Hanno, inoltre, capito che in alcuni punti i due filamenti erano più vicini (minor groove 12 Armstrong) e più lontani in altri (major groove 22 Armstrong) e che i fosfati fossero all’esterno delle basi azotate.

Pauling aveva posto i gruppi fosfato all’interno delle basi azotate e aveva proposto una struttura che comprendeva tre eliche che si combinassero. In realtà le triple eliche esistono, anche se non come nel modello di Pauling. Sono presenti in natura con un doppio strand normale, con una sequenza ricca di purina che si può aprire generando uno strand che può avvolgersi attorno agli altri due. Questo è un meccanismo adottato per bloccare i meccanismi di duplicazione e replicazione. In questa struttura c’è spazio per un altro legame a idrogeno tra le basi azotate: le basi A e T possono legarsi ad un terzo elemento e formare un legame a idrogeno con un’altra base azotata. Questo legame è chiamato Hoogsteen bond (quello normale è chiamato legame Watson e Crick). Wilkins non ha contribuito alla foto dei raggi X ma ha trovato una struttura chiamata ADNA.

Con le proteine i segnali sono più deboli, perché non sono presenti molti gruppi fosfato. Le proteine umane cristallizzate non sono fosforizzate perché quando vengono prodotte in grandi quantità da E. coli (dopo aver inserito al suo interno i geni responsabili della loro produzione), non subiscono questa modifica post-traduzionale.

Alla base della struttura di Watson e Crick

Anche il diametro dell’elica era stato dedotto dai dati di Wilkins e Franklin. Tutte le misure di legame sono state prese in considerazione per capire come le basi azotate si legano. Il diametro medio della doppia elica è pari a 2 nm (20 A):

• Pirimidina + pirimidina: DNA troppo stretto;
• Purina + purina: DNA troppo largo;
• Purina + pirimidina: la larghezza del DNA è coerente con i dati ottenuti dai raggi X.

Hanno capito che tutto coincide quando i due filamenti sono in senso opposto: uno che va da 5’ a 3’ e l’altro in senso contrario. In questo modo entrambi i filamenti cominciano con un gruppo fosfato e terminano con il gruppo -OH dello zucchero.

Il desossiribosio presenta un gruppo ossidrilico in meno rispetto al ribosio in posizione 2 e presenta un gruppo ossidrile in posizione 3. Il quinto carbonio presenta il gruppo fosfato che si lega al gruppo ossidrile dell’altro nucleoside.

Si hanno due tipologie di basi azotate con una struttura aromatica:

• Purine: anello aromatico di 6 atomi con 2N e 4C;
• Pirimidine: eterociclo aromatico di 9 atomi con 4N e 5C.

Si possono aggiungere dei gruppi extra che possono alterare la funzionalità.

Questa struttura però è flessibile e può cambiare. Per esempio, una modificazione può provocare lo spostamento di un gruppo amminico creando confusione per i legami con la base complementare.

Accoppiamenti tra basi complementari: legami Watson e Crick. Sono gli anelli a 6 atomi di carbonio che sono coinvolti nei legami a idrogeno, mentre il pentano presente nelle pirimidine sono coinvolti per i legami nella tripla elica.

All’interno della struttura del DNA si possono trovare 3 tipi di legame:

• Legami covalenti: legami chimici forti che si formano condividendo gli elettroni tra gli atomi e lo si riscontra nelle basi, negli zuccheri e nei legami fosfodiesterici;
• Legami a idrogeno: legami deboli che si instaurano tra un atomo elettronegativo e un atomo di idrogeno (elettropositivo) che è covalentemente legato ad un secondo atomo elettronegativo;
• “Legami” idrofobici: l’associazione tra gruppi non polari quando presenti in soluzioni acquose per via della loro insolubilità nell’acqua. Fosfato e zuccheri sono idrofili, mentre le basi azotate sono poste all’interno