Biologia molecolare

Biochimica e biologia molecolare – biologia molecolare AA 2020-2021

14/04/21

Nucleotidi

Costituenti degli acidi nucleici. Ai primordi, l’atmosfera era ricca di acido cianidrico che, per polimerizzazione, può dar vita ad una base azotata quale l’adenina. Nel 1869, Friedrich Miescher scoprì che trattando un leucocita con una soluzione alcalina precipitava una sostanza che definì poi nucleina. L’informazione genetica è codificata nella molecola di DNA, la quale viene trascritta grazie alla sintesi di una molecola di RNA complementare al filamento di DNA; questa viene poi letta e tradotta dai ribosomi in una sequenza di aa e quindi in proteine. Questo processo rappresenta il dogma centrale della biologia molecolare: DNA → RNA → proteina.

I nucleotidi sono i costituenti degli acidi nucleici. Sono presenti 5 nucleotidi totali, ma ogni acido nucleico ne può contenere solo 4. Possiamo distinguere due classi di nucleotidi:

• Purinici: adenina e guanina;
• Pirimidinici: timina, citosina e uracile.

Vediamo la struttura e i componenti di un singolo nucleotide:

• Zucchero a 5 atomi di C: può essere D-ribosio, per l’RNA, o 2-deossi-D-ribosio, per il DNA. La differenza tra i due zuccheri è minima, ma ha conseguenze sia sulla struttura secondaria che sulla stabilità degli acidi polinucleotidici. Quando numeriamo gli atomi dello zucchero, si aggiunge ad apice un ‘ in modo da distinguerlo dalla numerazione degli atomi della base azotata. Essendo zuccheri pentosi, l’anello che si genera sarà furanosico, e disporrà il C2’ (ma anche il C-3’) o sopra o sotto al piano: nel primo caso sarà endo, nel secondo eso. La conformazione preferita nell’RNA è la C3’-endo, mentre nel DNA è preferita la C2’-endo;
• Base azotata: legata allo zucchero. Di due tipi:
  • Pirimidiniche: anello pirimidinico. Sono tre:
    • Citosina;
    • Timina;
    • Uracile.
  • Puriniche: imidazolo e pirimidina condensate tra di loro. Sono due:
    • Adenina;
    • Guanina.

Lo zucchero si lega sulla posizione 1 delle due basi. Le basi sono soggette a tautomeria cheto-enolica, dove la forma carbonilica è più stabile di quella idrossilica. La capacità delle basi di poter passare da una forma chetonica ad una enolica è molto importante a livello metabolico, poiché c’è il rischio che non vengano riconosciute al momento della formazione del nuovo acido nucleico. Sono basi, e perciò hanno peculiarità basiche. Sono abbastanza idrofobiche, e ciò ha ripercussioni anche sulla struttura finale dell’acido nucleico. Esistono, oltre alle 5 basi principali, anche altre basi azotate riscontrabili in strutture particolari degli acidi nucleici dell’RNA transfer: ipoxantina, inosina, xantina;

• Gruppo fosfato: legato allo zucchero e facente ponte tra i nucleotidi. P può legarsi o al 5’ o al 3’ dello zucchero tramite legame fosfodiesterico. Se P si lega al 5’ possiamo trovare altri gruppi fosfato legati al primo, ottenendo nucleotidi mono-, di- o tri- fosfati. Il legame tra i vari P è di tipo fosfoanidridico.

L’unione tra zucchero e base azotata avviene per legame N-glicosidico, dove la base usa l’N, 1 per le pirimidine e 9 per le purine, per legarsi al C1’ dello zucchero. Il legame può trovarsi nella conformazione sin o anti: la prima vede la base situata sopra lo zucchero, mentre la seconda vede la base dalla parte opposta rispetto allo zucchero. Tra le due, la conformazione preferita è la anti. Queste strutture, costituite solo da zucchero e base azotata, prendono il nome di nucleosidi: adenosina e guanosina per le purine, citidina, timidina e uridina per le pirimidine. Aggiungendo il gruppo fosfato ai nucleosidi otteniamo i nucleotidi, quindi esteri fosforici dei nucleosidi. I nucleotidi hanno, oltre che la funzione strutturale degli acidi nucleici, anche funzioni di deposito di energia, di mediazione dei processi cellulari, di coenzimi o di intermedi di reazione. I nucleotidi più noti sono ADP e ATP. Derivati dell’AMP sono:

• cAMP: prodotto dall’adenilato ciclasi. Attiva le chinasi cAMP-dipendenti a livello cellulare;
• cGMP: analogo al cAMP. Non è però un suo derivato.

Altre strutture nucleotidiche sono analoghi sintetici dei nucleotidi, ovvero molecole simili ai nucleotidi che possono essere utilizzati per bloccare le attività degli acidi nucleici come la duplicazione del DNA; vengono perciò usati come antivirali e antitumorali.

Acidi nucleici: polinucleotidi formati dall’unione dei vari nucleotidi. Ogni nucleotide presenta in 5’ un P e in 3’ un OH: il P di un nucleotide reagisce con il 3’ del secondo nucleotide per formare un ponte fosfoestereo tra i due nucleotidi. Per convenzione, il filamento si indica in direzione 5’ → 3’. Il primo nucleotide è quello col P in 5’ libero, e l’ultimo è quello con l’OH in 3’ libero. Questa lettura corrisponde alla lettura N → C delle proteine. Il legame che si forma tra l’OH e il P è un legame fosfodiesterico. I gruppi P hanno pKa abbastanza bassi, poiché sono acidi forti, e perciò a pH=7 sono carichi negativamente; queste cariche li rendono meno attaccabili dall’acqua, impediscono attacco nucleofilo, e quindi meno idrolizzabili, poiché le cariche stabilizzano le strutture che formano. I nucleotidi sono presenti in varie forme nella cellula, dove svolgono funzioni diverse:

• ATP: più presente in qualsiasi cellula;
• Nucleotidi adenilici: molto presenti nei globuli rossi;
• NAD+ e NADH: presenti in tutte le cellule del fegato;
• In condizioni ipossiche aumentano i nucleotidi mono- e di- fosfato poiché nelle reazioni di ossidazione, fortemente esoergoniche, l’energia liberata dall’ossidazione dei nutrienti viene utilizzata per produrre ATP; in cellule con basse concentrazione di O la produzione di ATP è minore e prevarranno ADP e AMP;
• La concentrazione dei ribonucleotidi è maggiore di quella dei deossiribonucleotidi. La quantità di DNA è sempre la stessa, mentre la quantità di RNA varia a seconda della necessità della cellula visto che hanno funzione sia di sintesi proteica che di cofattori o altro;
• La concentrazione di nucleotidi totale è essenzialmente costante, ovvero ATP + ADP + AMP = costante, e perciò i loro rapporti saranno diversi a seconda delle condizioni cellulari. Anche NADH + NAD+ è mantenuta costante.

19/04/21

Metabolismo dei nucleotidi purinici

I nucleotidi possono essere prodotti ex novo o riciclati dalla dieta e dalla degenerazione di altre cellule, es. sintesi dei globuli rossi, cellule morte; in generale, il deossiribosio contenuto nei nucleotidi del DNA viene prodotto dalla riduzione del ribosio in seguito alla formazione dei ribonucleotidi. L’anello purinico è un biciclo aromatico costruito direttamente sul ribosio; l’origine degli atomi che lo formano fu scoperta da Buchanan, scienziato che alimentò dei piccioni con composti marcati e analizzò successivamente l’acido urico prodotto dagli stessi, arrivando a definire che:

• N1: da Asp;
• N3 e N9: da Glu;
• C4, C5 e N7: da Gly;
• 3-C6: da CO2, o HCO3;
• C2 e C8: da THF, tetraidrofolato, molecola generalmente responsabile del trasporto di unità monocarboniose.

Tutti gli enzimi responsabili di questa sintesi vanno ad organizzarsi in un supercomplesso, ovvero un’associazione di enzimi che partecipano ad una stessa funzione metabolica. Il vantaggio della formazione del supercomplesso è il fatto che la reazione viene velocizzata poiché il substrato viene incanalato continuamente verso l’enzima successivo dopo modificazione. Il prodotto finale di questa sintesi è IMP, ovvero inosina monofosfato; questa molecola è il precursore di tutti gli altri nucleotidi purinici e perciò di GMP e AMP. In generale, il processo deve essere spontaneo, e la velocità complessiva viene data dalle singole velocità dei vari processi; tra di essi, non tutti daranno lo stesso contributo a causa del fatto che le varie reazioni saranno differenti. Per agire farmacologicamente sulla sintesi delle basi puriniche, ad esempio in caso di neoplasie, sarà consigliato agire su quegli enzimi le cui reazioni hanno valori di Δ ≪ 0, e quindi spontanee, la cui regolazione è di tipo allosterico: così facendo, anche se la concentrazione di S è molto grande, l’enzima lavorerà poco e la sua velocità diminuirà. In generale, per qualsiasi processo metabolico, sarà presente un solo enzima fornente il contributo maggiore: questo costituirà la tappa di comando della via metabolica. Questa tappa deve essere specifica per la via stessa, in modo tale che il regolatore, e quindi l’inibitore, agisca solo su quell’enzima e non sugli altri.

Le vie metaboliche possono essere lineari o ramificate: lineare vede il passaggio di S dall’inizio alla fine all’interno di una sola via; ramificata vede più vie che partono da uno stesso intermedio. In caso di via ramificata, la reazione limitante è quella successiva alla ramificazione della via.

Vediamo la cascata di reazioni che portano alla sintesi finale:

• 1. Formazione del PRPP: come abbiamo già detto, l’anello purinico viene costruito direttamente sul C1 del ribosio-5-P; questo deve però essere attivato, in modo tale da permettere l’attacco delle unità successive. Per farlo, entra in gioco un enzima quale la ribosio fosfato pirofosfochinasi, il quale idrolizza un ATP ad AMP e introduce sul C1 del ribosio-5-P un gruppo pirofosfato PP; si genera così il 5-fosforibosil-α-pirofosfato, PRPP. Questa reazione rappresenta lo stadio limitante dell’intero processo, ed è una delle due tappe fondamentali della sintesi;
• 2. Introduzione di N9: l’N deriva da un residuo di Gln. La reazione vede la sostituzione del PP con un gruppo amminico in posizione β; il gruppo amminico viene sottratto ad una Gln che viene così trasformata in Glu. L’enzima responsabile di questa tappa è l’amidofosforibosil transferasi, il quale produce β-5-fosforibosilammina, PRA. Questo step rappresenta la tappa di comando di tutto il processo.

La Gln è un substrato critico per la sintesi sia dei nucleotidi pirimidinici che purinici: è infatti coinvolta in 3 reazioni per le purine e in 2 reazioni per le pirimidine. Vediamo la cinetica della reazione per questo step: la regolazione dell’attività dell’enzima vede una cinetica di tipo iperbolico. Normalmente i valori di Gln presenti nelle cellule sono attorno alla di questa cinetica, rimanendo abbastanza stabili a meno di condizioni particolari. L’enzima non viene quindi influenzato particolarmente dalla concentrazione di Gln, ma piuttosto da quella del PRPP: la cinetica assume infatti, in sua presenza, un andamento sigmoide. I valori di PRPP variano molto e quindi regolano in maniera diversa l’enzima. Inoltre, l’attività dell’enzima può essere ridotta in presenza di IMP, GMP e AMP: questo perché l’enzima possiede due siti allosterici, uno per IMP e l’altro per AMP e GMP. Quando entrambi i siti vengono occupati, si ha lo sviluppo di un effetto sinergico che provoca la dimerizzazione dell’enzima riducendone l’attività; in assenza degli inibitori, invece, l’enzima si trova nella forma monomerica più attiva. In generale, il PRPP tende a spostare l’equilibrio verso la forma monomerica, attivando l’enzima, mentre i nucleotidi tendono a spostarlo verso la forma dimerica, disattivando l’enzima.

• 3. Introduzione di C4, C5 e N7: reazione tra PRA e un residuo di Gly. La reazione è catalizzata dall’enzima GAR sintetasi, il quale, tramite consumo di un ATP, produce glicinammide ribotide, GAR;
• 4. Introduzione di C8: reazione tra GAR e un gruppo formilico portato dal tetraidrofolato. La reazione è catalizzata dall’enzima GAR transformilasi, il quale produce formilglicinammide ribotide, FGAR;
• 5. Introduzione di N3: si ha la reazione tra FGAR e una seconda molecola di Gln che diventa Glu. La reazione è catalizzata dall’enzima FGAM sintetasi, il quale, in presenza di ATP e acqua, produce formilglicinammidina ribotide, FGAM, tramite sostituzione di un gruppo C=O con un gruppo imminico;
• 6. Ciclizzazione: reazione ATP-dipendente catalizzata dall’enzima AIR sintetasi, il quale produce 5-amminoimidazolo ribotide, AIR;
• 7. Introduzione di C6: reazione che introduce sul C5 un gruppo carbossilico. La reazione è catalizzata dall’enzima AIR carbossilasi, il quale, in presenza di ATP, produce carbossiamminoimidazolo ribotide, CAIR;
• 8. Introduzione di N1: reazione che introduce sul C6 un residuo di Asp. La reazione è catalizzata dall’enzima SAICAR sintetasi, il quale, in presenza di ATP, produce 5-amminoimidazolo-4-(N-succinilcarbossiammide) ribotide, SAICAR.
• 9. Eliminazione di fumarato: reazione che rimuove dalla struttura tutti gli atomi di Asp non necessari alla sintesi. Dalla reazione viene a formarsi fumarato, ovvero la forma ossidata dell’Asp. La reazione è catalizzata dall’enzima adenilsuccinato liasi, il quale produce 5-amminoimidazolo-4-carbossiammide ribotide, AICAR;
• 10. Introduzione di C2: reazione tra AICAR e un gruppo formilico portato dal tetraidrofolato, permettendo così l’introduzione dell’ultimo C del secondo anello. La reazione è catalizzata dall’enzima AICAR transformilasi, il quale produce 5-formamminoimidazolo-4-carbossiammide ribotide, FAICAR;
• 11. Chiusura dell’anello: reazione catalizzata dall’enzima IMP cicloidrolasi, il quale produce inosina monofosfato, IMP.

Il processo in generale consuma tra le 6 e le 7 molecole di ATP per ogni molecola di IMP prodotta; l’incertezza è dovuta all’azione dell’enzima AIR carbossilasi coinvolto nella 7° reazione: questo, a differenza delle altre carbossilasi, non utilizza né ATP né biotina per funzionare, poiché è in grado di legare direttamente la CO2. È costituita da 2 subunità, una legante il gas e l’altra in grado di idrolizzare ATP; la sub che lega CO2 ha una molto alta, e di conseguenza sarà necessario idrolizzare un ATP per poter abbassare l’affinità della carbossilasi per la CO2 e permettere il rilascio della molecola.

21/04/21

La biosintesi de novo dei nucleotidi purinici può essere influenzata e regolata, sulle reazioni 4 e 10, tramite l’utilizzo di analoghi del folato; esistono infatti molecole analoghe strutturali che possono essere utilizzate come antimetaboliti e/o agenti antimicrobici poiché competeranno con il folato inattivando gli enzimi. Esempi di queste molecole sono i sulfamidici, il metotrexato e l’aminopterina.

La sintesi di GMP e AMP, a partire dall’IMP, necessita di energia:

• AMP: energia fornita dal GTP. Il passaggio da IMP ad AMP avviene grazie ad una adenilsuccinato sintetasi, enzima che porta alla formazione di adenilsuccinato per reazione tra IMP e un Asp; a questo punto, il legame tra N e il Cα dell’Asp viene tagliato ad opera dell’adenilsuccinato liasi, la quale porta alla formazione di AMP e fumarato;
• GMP: energia fornita dall’ATP. Il passaggio da IMP a GMP avviene grazie ad una IMP deidrogenasi in presenza di NAD+, che viene ridotto a NADH; si forma così xantosina monofosfato, XMP, nucleotide che va a reagire, grazie alla GMP sintetasi, con una Gln per formare GMP e Glu.

Nella trasformazione dell’IMP in GMP, la prima reazione è catalizzata da una deidrogenasi; questo enzima può essere inibito dall’acido micofenolico, composto solitamente utilizzato come immunosoppressore in caso di trapianti poiché il sistema immunitario, in seguito all’operazione, si attiverà in risposta alla presenza di antigeni estranei sulle cellule del tessuto trapiantato. Bloccando l’azione del singolo enzima, si blocca conseguentemente la sintesi del DNA necessaria anche alla produzione di nuovi linfociti. Il controllo dell’intera sintesi di nucleotidi purinici può essere eseguito su diversi punti del processo:

• 1° reazione: l’enzima ribosio fosfato pirofosfochinasi può essere inibito dai nucleotidi purinici. La reazione non è la tappa di comando poiché è comune ad altre vie;
• 2° reazione: tappa di comando. L’enzima su cui si va ad agire è l’amidofosforibosil transferasi, enzima che, legando contemporaneamente sui suoi due siti regolatori AMP e o GMP o IMP, genera un effetto sinergico che riduce drasticamente la sua attività. Per produrre un effetto attivatore si usa invece PRPP, già scritto prima;
• []Adenilsuccinato sintetasi: enzima regolato da feedback negativo, dove l’inibizione è dovuta a troppo alte;
• []IMP deidrogenasi: enzima regolato da feedback negativo, dove l’inibizione è dovuta a troppo alte.

Se AMP e GMP inibiscono la loro stessa sintesi provocano di conseguenza un accumulo di IMP, il quale inattiva a sua volta la tappa di comando dell’intera sintesi, 2° reazione. Ciò provoca un’inibizione retroattiva a tappe che permette il mantenimento di un corretto equilibrio nelle concentrazioni di nucleotidi adenilici e guanilici, poiché se uno dei due nucleotidi è troppo concentrato e inibisce la sua sintesi sarà disponibile più IMP per la sintesi dell’altro nucleotide, il quale inibirà poi la sua stessa sintesi a livelli di concentrazione troppo elevati.

Come abbiamo già detto in precedenza, i nucleotidi possono essere anche riciclati da altre cellule o degenerate o prelevate attraverso la dieta. Le vie di riciclo recuperano nucleotidi quali l’ipoxantina, base dell’inosina, e la guanina, ricombinandole poi