Biologia dello sviluppo - Appunti completi dalle lezioni

INTRODUZIONE

OBIETTIVI: fornire le conoscenze di basi inerenti alle fasi, ai processi e ai meccanismi che portano la cellula uovo

fecondata, o zigote, a dividersi e ad attivare l’espressione di specifici geni per produrre un organismo

pluricellulare composto da diversi tipi cellulari. Quindi capire come si arriva alla pluricellularità con tipi cellulari

diversi partendo dall’unicellularità. Tramite il differenziamento: verrà molto approfondito, verranno spiegati

quali sono i meccanismi che controllano il differenziamento cellulare o lo svilupparsi di un organismo

pluricellulare complesso, funzionante e integrato con il suo ambiente, partendo da un’unica cellula. Poi verrà

trattata la morfogenesi: come le cellule dell’embrione possono migrare, organizzandosi in foglietti separati e

costituire organi distinti. Verrà spiegato l’accrescimento e i meccanismi che lo regolano, come viene regolata la

crescita delle varie strutture dell’embrione e la proliferazione cellulare (controllo). La riproduzione: come si

distinguono le cellule germinali; l’evoluzione (modificazioni ereditarie che originano nuove forme) e

l’integrazione ambientale (in che modo l’ambiente influenza lo sviluppo embrionale).

NB: tutte le cellule hanno lo stesso DNA ma esprimono geni diversi.

METODI SEGUITI PER FARE BIOLOGIA DELLO SVILUPPO

All’inizio seguiva un procedimento anatomico/morfologico (venivano descritti i processi che avvengono durante

l’embriogenesi). Poi si è cominciato a seguire un procedimento di tipo sperimentale: si vanno a studiare gli

effetti prodotti dalle manipolazioni sugli embrioni e come l’ambiente esterno influenza lo sviluppo

dell’embrione. In ultimo si utilizza un approccio genetico: qui si studia il controllo esercitato dai geni sullo

sviluppo dell’embrione, isolando i geni che lo modificano; studia i processi biologici a livello dei meccanismi

molecolari. In ultima analisi, la biologia dello sviluppo è una scienza di sintesi che riceve contributi da numerose

discipline diverse.

FASI DELLO SVILUPPO EMBRIONALE

I primi procedimenti successivi alla fecondazione della cellula uovo sono circa uguali in tutti gli organismi (lo

sviluppo dipende anche dalla temperatura). I primi eventi avvengono da un punto di vista temporale nel giro di

ore, poi con l’organogenesi si parla di giorni. Tuttavia nell’ambito della biologia dello sviluppo si parla di stadio e

non di ore. Subito dopo la fecondazione avviene la segmentazione: una fase di intensa proliferazione cellulare

in cui però mancano le fasi di crescita G1 e G2; per cui l’enorme massa del citoplasma dello zigote viene

suddiviso in cellule di dimensioni inferiori, dette blastomeri che alla fine della segmentazione formano una

struttura sferica detta blastula. Segue la gastrulazione: qui le cellule vanno incontro a movimenti morfogenetici

con i quali modificano le loro reciproche posizioni. Al termine di questo processo l’embrione prende il nome di

gastrula ed è costituito da tre foglietti embrionali: ectoderma, mesoderma e endoderma. Durante la

gastrulazione cambia anche la forma delle cellule e inizia anche la fase trascrizionale delle cellule. Segue poi

l’organogenesi: quel processo mediante il quale i diversi tipi cellulari completano i loro processi differenziativi e

si organizzano per formare tessuti e organi. Nei vertebrati l’inizio dell’organogenesi è rappresentato dalla

neurulazione, ovvero dalla formazione del tubo neurale, che darà origine al cervello e al midollo spinale.

Riguardo all’organogenesi, sarà molto approfondito lo sviluppo dell’arto. Nel ciclo vitale degli animali a sviluppo

indiretto subentra la metamorfosi: una fase corrispondente al passaggio da uno stadio giovanile o larva

(immaturo sessualmente) allo stadio adulto (sessualmente maturo); tale fase richiede una trasformazione

radicale nell’anatomia dell’organismo, spesso anche di ambiente e modo di vita (interessa sia molte specie di

invertebrati sia vertebrati). Un’altra fattore che interessa lo sviluppo di un individuo è la rigenerazione: che

consiste nella riattivazione dello sviluppo durante la vita post-embrionale per ricostruire tessuti perduti (non

tutti gli organismi sono in grado di attuarlo, il tritone per esempio si). Un altro

fattore implicato nella biologia dello sviluppo sono le malformazioni (a volte

costituiscono proprio le basi della biologia dello sviluppo): sono anomalie

dovute a cause genetiche; a volte le malformazioni che possono presentarsi in

organismi diversi, possono generare pattern (fenotipi) simili. Le anomalie non

dovute a cause genetiche, bensì dovute a agenti esogeni (sostanze

teratogeniche) sono definite disordini dello sviluppo. 1

CENNI STORICI

Il primo studio di anatomia comparata dello sviluppo risale ad Aristotele: descrisse per primo lo sviluppo

embrionale del pulcino. Sceglie il pulcino perché è molto facile studiarne la biologia dello sviluppo perché

posso aprire una finestra nel guscio e seguire di conseguenza tutte le fasi che avvengono nell’embrione in

via di sviluppo, senza lesionarlo. Propose anche l’idea di epigenesi: tutte le cellule (blastomeri) di un

embrione precoce hanno simili potenzialità morfogenetiche e si differenziano gradualmente nei

successivi stadi dello sviluppo (la forma e la struttura degli embrioni emergono gradatamente con il

procedere dello sviluppo). Quindi gli organi si formano de novo; tuttavia non si parte da uno stato

disorganizzato, in quanto lo zigote è già organizzato (non casuale) sia a livello cellulare che molecolare.

Una teoria completamente opposta è il preformismo: esistono degli embrioni in miniatura all’interno

delle cellule germinali, nello spermatozoo (non nella cellula uovo per la figura della donna nelle tradizioni

dell’epoca); questo embrione crescerebbe diventando via via più grandi con lo sviluppo. Quindi contrariamente

alla prima teoria, le informazioni per lo sviluppo sono presenti, preformate, nello zigote. Pander Christian: ha

scoperto i foglietti embrionali. Tutti i vertebrati hanno un modello di sviluppo comune che prevede la

formazione di tre strati: ectoderma, endoderma, mesoderma. Rathke: scopre che questi foglietti non si

differenziano in modo autonomo ma si influenzano a vicenda, necessitano della comunicazione reciproca tra

cellule: induzione. Karl Ernst von Baer: scopre la notocorda e la cellula uovo nei mammiferi. Secondo la sua

teoria, tutti i vertebrati si sviluppano in modo fondamentalmente simile: nelle prime fasi dello sviluppo, gli

embrioni appaiono molto diversi tra loro, a causa delle diverse richieste nutrizionali ed ecologico

dell’organismo. Poi subentra però lo stadio filotipico, che attraversano tutti i

vertebrati, in cui tutti gli embrioni si somigliano molto (passano per questa

strettoia). A questo stadio l’embrione, costituiti dai tre foglietti embrionali, possiede

una testa riconoscibile, un tubo neurale, archi branchiali e somiti. Una volta

superata questa strettoia gli embrioni cominciano a differenziarsi nuovamente,

facendo emergere le caratteristiche specifiche della classe, dell’ordine e della

specie. Gli embrioni in questo stadio filotipico sono stati studiati anche dal punto di vista molecolare: è stato

osservato che in questo stadio vengono espressi i geni più antichi, ovvero quelli maggiormente comuni a tutti

gli organismi. Questa teoria differisce dalla precedente teoria che prevedeva una somiglianza iniziale e un

progressivo differenziamento.

LE CELLULE SONO TUTTE UGUALI?

Nella blastula le cellule sono tutti uguali ma già aventi un proprio destino; ecco

perché si fanno delle mappe presuntive, che illustrano proprio il destino delle

singole cellule, identificano la struttura larvale o adulta nella regione dell’embrione

dalla quale tale struttura deriverà (i colori con cui vengono effettuate queste mappe

presuntive cambiano da libro a libro). Vengono anche chiamate mappe del destino.

La prima mappa presuntiva è stata fatta nel 1905 da Conklin. Dopo la fecondazione

il citoplasma tende a spostare parte del citoplasma nella zona più in basso (di color

arancione): sono le cellule che andranno a costituire la muscolatura della coda di

questa larva (se io prelevo queste cellule la larva sarà priva di coda). Questo è il mioplasma, costituito da

pigmenti naturali posseduti dall’uovo che possono funzionare da marcatori (è dunque una colorazione naturale

che permette di seguire i movimenti e il destino delle cellule). Si è capito che la colorazione può essere fatta

anche artificialmente: marcature sperimentali che possono essere realizzate con coloranti vitali (per esempio

viene utilizzato l’agar con il colorante; se viene messo sull’embrione, questo rilascia colore che va a legarsi a

particolari cellule dell’embrione che poi si dividono, spostandosi durante la formazione dell’embrione e

mostrando i movimenti delle cellule stesse e quindi il loro destino); tuttavia questa tecnica presenta un

problema, dovuto alla progressiva diluizione del colorante ad ogni divisione cellulare, quindi il colore si

disperde. Ecco perché vengono anche fatte mappe presuntive utilizzando sostanze fluorescenti: esse

permangono di più, anche dopo molte divisioni cellulari, rispetto al colorante (tuttavia si parla sempre di un

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tempo limitato). Un altro problema risiede nel fatto che non risulta sempre facile colorare le cellule giuste. Ecco

che dunque si arriva al 1969 con un importante novità: mappa presuntiva mediante marcatura genetica. Tale

tecnica sfrutta il fatto che gli organismi sono diversi dal punto di vista molecolare, biochimico: per cui vengono

costruiti embrioni chimera nei quali le cellule sono geneticamente diversi. Un esempio è il trapianto di cellule di

quaglia in un embrione di pollo; in tal modo i mosaici genetici evitano la diluizione del

marcatore dovuta al procedere delle divisioni cellulari. L’embrione di pollo differisce da

quello di quaglia per densità di eterocromatina all’interno del nucleo delle cellule.

Sfrutta i trapianti. Vengono utilizzati embrioni transgenici (chimere ottenute mediante

DNA transgenico): questa procedura sfrutta geni house keeping che

codificano per proteine house, perché sono indispensabili per la cellula,

quindi presenti in tutte le cellule. Se io prendo un gene contenente il

promotore di una proteina house keeping e lego ad esso un gene

codificante per una proteina fluorescente e lo impianto in un organismo, questo diventerà tutto fluorescente.

Trasferisco poi delle cellule dell’organismo fluorescente su un altro organismo nella stessa posizione in cui le ho

prelevate e in tal modo posso osservare il percorso che queste cellule compiono durante lo

sviluppo e quindi il loro destino. Posso inoltre anche far crescere in vitro delle cellule

prelevate da un organismo: gli espianti consentono di studiare il destino di uno specifico

gruppo di cellule senza l’influenza delle cellule circostanti; per esempio posso far crescere

in vitro cellule a destino ectodermico, modificando

però contemporaneamente l’ambiente circostante: se

modifico l’informazione esterna variando ad esempio

le concentrazioni dei componenti dell’ambiente in vitro, tali cellule si

differenziano in modo diverso => per cui una cosa è il destino, una cosa è

il differenziamento. Gli embrioni possono essere manipolati: cutting, pasting, painting. La procedura di pasting

(a, b) consiste nell’iniezione di mRNA all’interno dell’embrione, portando alla formazione di

organi ectopici (come la formazione di un occhio ectopico nello Xenopus, inserendo il

recettore di Frizzled 3 allo stadio di 8 cellule). Tuttavia non si sa se questo occhio sia o

meno funzionante; ecco perché si segue la procedura di painting (c, d), consistente

nell’immunolocalizzazione di Pax 6 nell’occhio normale ed ectopico (Pax 6 è un gene

fondamentale nella fase di neurogenesi e oculogenesi, quindi durante la formazione del

sistema nervoso dell’occhio). Si nota che l’occhio risulta sviluppato, ma manca la parte del

sistema nervoso che quindi non lo rende funzionante. La procedura di cutting (e, f) invece

consiste nell’iniezione di RNA codificante per un dominante negativo di Frizzled 3 (in questo

caso), generando così il mancato sviluppo dell’occhio: tolgo parte di un organismo.

Un'altra tecnica utilizzata è l’ibridazione in situ: tecnica citogenetica che può essere

utilizzata per rilevare e localizzare la presenza o l'assenza di specifiche sequenze di DNA

nei cromosomi in cellule e tessuti morfologicamente conservati. Essa utilizza delle sonde

geniche marcate a fluorescenza che si legano in modo estremamente selettivo per via di

una sequenza complementare ad alcune specifiche regioni del cromosoma. Come già

detto i trapianti consentono di studiare il destino di uno specifico gruppo di cellule, ma

consentono anche di studiare l’influenza che un gruppo specifico di cellule ha sulle

cellule circostanti. Un trapianto può essere omospecifico (stessa specie), eterospecifico

(specie diverse), eterocronico (età differente), eterotopico (regioni diverse dello stesso embrione). Il trapianto

può essere anche effettuato su una zona diversa dall’espianto; può essere anche effettuato in una fase

embrionale successiva. Spemann: trapianta cellule del labbro dorsale del blastoporo di un embrione nella

regione ventrale della gastrula di un altro embrione: in tal modo voleva verificare se le

cellule mantengono il loro proprio destino o sono influenzate dalle cellule circostanti.

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L’effetto di tale esperimento fu la formazione di un asse secondario e un secondo embrione, per cui le cellule in

questo caso non influenzano le altre.

Un’altra procedura è il knockout genico, ovvero il silenziamento genico: se voglio sapere

cosa fa un gene, lo silenzio e vedo che effetti ha (produco embrioni che ne sono privi); il

knockout genico nel topo si basa sul processo della ricombinazione omologa. Per

esempio topi senza VDR (regola l’invecchiamento), hanno un invecchiamento più rapido.

Vado ad inserire una sequenza che interrompe il gene e quindi me lo inattiva; se

l’embrione nasce (perché non è certo che sopravviva), vado poi a vedere che fenotipo

presenta. Oppure posso anche aggiungere un gene, non solo toglierlo. Un’altra tecnica è

la CRISPR/Cas9: è una mutagenesi mirata con la quale posso individuare e correggere

geni mutati (viene anche utilizzata per la cura di alcune patologie).

Un gene può anche essere silenziato, senza però essere eliminato: knockdown genico

(per un breve periodo di tempo determinato è molto efficace): consiste

nell’inattivazione funzionale di geni mediante oligonucleotidi antisenso “morpholino”

che non modificano il DNA ma interferiscono con la sua espressione (si crea un breve

filamento di DNA modificato con il morpholino complementare all’mRNA: si

complementano e impedisce la traduzione della proteina, generando un mRNA

inattivo). Esistono due tipi di morpholino: il morpholino ATG che agisce a livello

ribosomiale, per cui a livello citoplasmatico; quindi interessa sia mRNA materni che

embrionali. Questo tipo di morpholino si appaia con la sequenza di inizio responsabile dell’appaiamento con il

ribosoma, creando un ingombro che impedisce la traduzione. Esiste un altro tipo di morpholino che però

interagisce con un pre-mRNA, quindi all’interno del nucleo, impedendo il corretto meccanismo di splicing

(morpholino splicing) e impedendo quindi la traduzione; questo morpholino agendo nel nucleo, blocca la

traduzione solamente degli mRNA embrionali, non materni che invece sono presenti nel citoplasma. Quindi c’è

un morpholino che agisce solo sugli mRNA embrionali, uno che agisce sia su quelli embrionali sia su quelli

materni; in tal modo è possibile verificare se l’mRNA materno, quindi il messaggio materno, è importante e

fondamentale per lo sviluppo di parti dell’embrione o meno (es: il tubo neurale). Gli effetti del gene possono

essere studiati anche mediante una maggiore espressione del gene stesso (gain of function).

È importante notare inoltre che alcuni organismi modello non sempre sono simili all’uomo (per esempio per

alcuni caratteri a volte è più simile all’uomo la Drosophila, piuttosto che il topolino). Ciò avviene perché i geni

che controllano le fasi precoci dello sviluppo embrionale sono evolutivamente conservati.

EQUIVALENZA DEL GENOMA E TRASCRIZIONE GENICA

Per molti anni gli studiosi si sono chiesti se tutte le cellule dell’organismo avessero lo stesso identico genoma.

Hans Spemann propose un esperimento che poteva trovare una risposta a questa domanda: pensò di inserire il

nucleo di una cellula completamente differenziata all’interno di una cellula uovo priva di nucleo, osservando se

questa fosse in grado di dare origine ad un individuo simile a quello dal quale era stata prelevata la cellula

somatica. Tuttavia egli non disponeva della strumentazione necessaria per questo tipo di esperimenti. Nel 1938

legò con un capello una cellula uovo fecondata durante la sua prima divisione mitotica, lungo il piano di

divisione; tuttavia non strinse del tutto il nodo, permettendo di ottenere da una parte della strozzatura solo

citoplasma, mentre dall’altra i nuclei delle cellule che si stavano dividendo. Allo stadio di 16 blastomeri un

nucleo ha attraversato la strozzatura e a questo punto ha stretto completamente la strozzatura, dividendo

definitivamente i due embrioni. Il risultato da lui ottenuto fu la formazione di due tritoni uguali, ma con

dimensioni diverse: quello derivato da un solo nucleo era più piccolo perché aveva un ritardo nella fase di

segmentazione. In tal modo Spemann ha dimostrato l’equivalenza dei nuclei durante la segmentazione del

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tritone: non si può ritenere ancora una risposta definitiva in quanto questa dimostrazione è valida solo fino allo

stadio di 16 blastomeri e non ancora per una cellula completamente differenziata.

Per avere risposte più complete si deve