Appunti del modulo di Biologia dello sviluppo

Biologia dello sviluppo

“Non si ereditano gli organi ma il complesso di geni che sovrintendono alla loro formazione. Ed è impreciso affermare che nel corso dell’evoluzione una struttura biologica si sia trasformata in un’altra; quello che si trasforma è la realizzazione spazio-temporale di un programma generativo codificato e controllato da un complesso di geni”

La biologia dello sviluppo è quella disciplina che studia tutti i processi che riguardano lo sviluppo, dalla formazione del nuovo individuo al suo sviluppo e accrescimento. Comprendere come gli embrioni si sviluppano (da zigote a organismo formato) studia a livello macroscopico processi molecolari e cellulari. La cellula uovo fecondata è simile tra le varie specie, mentre l’organismo adulto è molto diverso. Succedono processi che determinano questi cambiamenti passando da stadi ben definiti ovvero:

• Formazione di un organismo pluricellulare → segmentazione
• Raggiungimento da parte delle varie cellule di una posizione che permette di ricevere segnali da cellule circostanti e dall’ambiente per svilupparsi in tessuto e organo specifico → gastrulazione
• Formazione dei veri tessuti ed organi

Espressione genica differenziale

Il controllo dello sviluppo è dovuto a differenze dell’attività genica. L’esperimento di Gurdon sancisce il principio dell’equivalenza genetica: tutte le cellule contengono la stessa informazione genetica dello zigote. Quindi le differenze tra le varie cellule dipendono dall’espressione genica differenziale.

Lo sviluppo è progressivo e può non essere più reversibile

Determinazione

Determinazione: cambiamento stabile della cellula dovuto a variazione delle attività geniche che provocano il cambiamento delle proteine prodotte dalla cellula. Una volta che la cellula è determinata, questo cambiamento stabile viene ereditato dalle cellule che ne derivano (lineage).

Lo dimostro prendendo un embrione già pluricellulare, ha due regioni da cui si originano tessuti differenti. Se prendo una cellula nella regione 1 e la trapianto in regione 2, se la cellula non è ancora determinata, si sviluppa come il tessuto in cui viene trapiantata; se una cellula è già determinata e viene trapiantata in una regione differente, si sviluppa secondo il destino che avrebbe avuto nel tessuto d’origine.

Specificazione

Specificazione: un gruppo di cellule si dice specificato quando, se isolato dal resto dell’embrione e coltivato in ambiente neutro, si sviluppa secondo il destino che avrebbe seguito nell’embrione.

Differenziamento muscolare

Inizialmente abbiamo mioblasti → cellule mononucleate. Se messi in coltura, necessitano di GF specifici per iniziare il differenziamento e proliferare. Dopo un tot di tempo di trattamento, smettono di proliferare, si allineano disponendosi in maniera allineata e si fondono → miotubi. Lo step successivo comporta una successiva attività di espressione genica → i miotubi producono proteine contrattili e il citoplasma si riempie di proteina contrattile e i nuclei vanno in periferia → devono lasciare spazio alle proteine contrattili.

Sviluppo dello zigote

Già allo stadio successivo alla cellula uovo, a seconda dell'organismo, la situazione non è identica. Nello stadio filotipico, gli embrioni di tutte le specie si assomigliano molto → la somiglianza morfologica è data da omologia di espressione genica.

Segmentazione

Sono una serie di divisioni mitotiche in cui l’enorme volume del citoplasma dell’uovo viene a suddividersi in numerose cellule nucleate più piccole, i blastomeri. La segmentazione dà inizio alla formazione di un individuo pluricellulare. La segmentazione è differente in base alla cellula uovo.

Cellula oligolecitica

In una cellula uovo con poco tuorlo (oligolecitica), la segmentazione avviene in tutto lo zigote, un esempio è il riccio di mare. Lo zigote si replica fino ad arrivare alla morula (16-32 c, sfera piena), le cellule sono ancora troppo grosse e quindi va incontro a ulteriori divisioni fino a formare la blastula che inizialmente è piena, poi si forma una cavità → blastocele. Si forma una cavità perché le cellule all’interno si devono spostare per formare i tre foglietti embrionali. Il blastocele è il nostro intestino.

Cellula telolecitica

In una cellula uovo con tanto tuorlo (telolecitica), la segmentazione avviene solo a un polo, il polo animale, mentre il resto rimane indiviso (polo vegetativo) e conterrà il materiale di nutrimento. Il primo e il secondo solco di divisione sono verticali, il terzo equatoriale. La segmentazione ha il compito di dividere i determinanti citoplasmatici nelle diverse popolazioni cellulari che formeranno l’embrione → diversi gruppi di cellule in cui posso attivare diversi tipi di geni.

Geni ad eredità materna

Nell'embrione, il ciclo cellulare è fatto da S e M, vengono saltate G1 e G2, fasi che servono a produrre fattori per la fase successiva. I primi stadi di sviluppo dell’embrione sono determinati da fattori materni, mRNA e proteine sintetizzate e deposte nell’uovo dalla madre. Quando inizia lo sviluppo, gli mRNA materni vengono tradotti e le proteine sintetizzate svolgono il loro compito di attivare altri geni a cascata con una precisa regolazione spazio-temporale lungo gli assi corporei: l’asse antero/posteriore e l’asse dorso/ventrale. I fattori generano un gradiente → si concentrano a seconda delle porzioni in cui sono localizzati → morfogeni: va ad attivare in maniera differenziale i geni in base alla sua concentrazione.

Gastrulazione

È una riorganizzazione delle cellule embrionali, è un processo caratterizzato da movimenti di cellule e tessuti durante il quale le cellule della blastula vengono completamente riorganizzate. Si distinguono per la prima volta i foglietti embrionali:

• Ectoderma:
  • Epidermide
  • Tessuto nervoso
  • Cresta neurale
• Endoderma: organi interni
• Mesoderma:
  • Notocorda → struttura assile di cordati: tubo di cellule che durante lo sviluppo regredisce e rimane solo nei dischi vertebrali
  • Cellule del sangue
  • Derma del dorso
  • Muscolatura scheletrica
  • Tessuto osseo

Ci sono cellule specifiche che danno origine ai gameti → cellule della linea germinale.

Gastrulazione in Xenopus leavis

Ha un uovo telolecitico. Ha sviluppo rapido → dalla fecondazione alla formazione della blastula passano 5 ore e poi inizia la gastrulazione. Il primo passo della gastrulazione è una piccola invaginazione chiamata blastoporo (labbro dorsale del blastoporo) sul lato dorsale della blastula. Le cellule che daranno origine al mesoderma e all’endoderma migrano a livello del blastoporo attraverso un processo chiamato involuzione. I tessuti convergono lungo la linea mediana e si estendono anteriormente e posteriormente attraverso un meccanismo di convergenza ed estensione. L’ectoderma si espande a ricoprire tutta la gastrula attraverso il meccanismo dell’epibolia. La cavità che si forma è l’archenton → intestino primitivo.

Gastrulazione in pollo

È un uovo telolecitico, la segmentazione avviene solo al polo animale → l’embrione si sviluppa da una piccola regione sul tuorlo → blastoderma. Il tuorlo è circondato dall’albume che contiene sostanze per mantenere l’ambiente adatto, le calaze servono a non far aderire il tuorlo alle pareti, c’è una sacca d’aria che è il primo punto dove il pulcino mette il becco.

Il blastoderma si divide e forma i foglietti. Durante la gastrulazione si forma una fessura (stria primitiva) da cui possono entrare le cellule, all’estremità anteriore si forma il nodo di Hensen. Il nodo inizia a spostarsi verso la parte posteriore e intanto le cellule continuano ad entrare.

Gastrulazione in uomo

Nell’uomo, l’uovo fecondato nell’ovidotto raggiunge l’utero circa dopo 5 giorni e l’impianto avviene a circa 7 giorni con una blastula di circa 256 cellule. In questa blastula sono individuabili delle cellule che formeranno l’embrione vero e proprio: la blastocisti e cellule del trofoblasto che formeranno gli annessi embrionali. Al 14° giorno inizia la gastrulazione.

L’embrione deriva dall’epiblasto, lo strato superiore di un disco di cellule bilaminare e piatto, lo strato inferiore di questo disco viene chiamato ipoblasto. Il disco è tra due cavità: la cavità superiore è la cavità amniotica, quella inferiore è il sacco vitellino.

Sul disco si forma una linea chiamata stria primitiva attraverso la quale le cellule dell’epiblasto fanno movimenti di ingressione per dare origine a mesoderma e endoderma. Le restanti cellule dell’epiblasto formano l’ectoderma.

Tra il giorno 22 e il giorno 28 avvengono dei movimenti di ripiegamento che fanno sì che l’embrione si modifichi a livello tridimensionale → la cavità amniotica si espande, assumendo una forma a fungo e va a proteggere l’embrione, mentre il sacco vitellino sottostante si riduce per formare un sacchetto. Le dimensioni del sacco vitellino si riducono perché il materiale nutritivo viene consumato dall’embrione mediante il tubo digerente → organi interni in contatto con il sacco vitellino. Grazie a questi ripiegamenti della cavità amniotica e del sacco vitellino, l’embrione al 28° giorno assume una forma tridimensionale e, così, termina la gastrulazione dell’uomo.

Formazione degli assi embrionali

Nell’uovo di Xenopus, il futuro lato dorsale si forma sul lato opposto al sito di penetrazione dello spermatozoo come risultato di ridistribuzione di fattori materni dorsalizzanti (proteine del WNT pathway). Questa regione formerà l’organizzatore di Spemann nel futuro lato dorso/ventrale dell’embrione. Quando lo spermatozoo penetra, dei fattori dorsalizzanti (fattori materni) accumulati in una regione migrano con un angolo di 30° in modo da posizionarsi in maniera diametralmente opposta al punto di penetrazione dello spermatozoo → primo asse embrionale: dorso-ventrale.

I fattori dorsalizzanti (fattori materni) cominciano a esprimere delle vie di segnalazione → via WNT → via di segnalazione che regola il destino dorsale dell’embrione insieme ad altri processi.

I segnali dorsalizzanti sono secreti durante la fase di segmentazione. Servono per definire il labbro dorsale del blastoporo o organizzatore di Spemann → regione dorsale da cui le cellule si invaginano e riescono ad entrare per dare origine ai tre foglietti embrionali.

Gli esperimenti sono stati condotti prendendo un embrione e dividendolo in due metà → prendono un capello e fanno un nodo all’embrione. Dividono l’embrione lasciando da una parte la porzione che contiene il punto di ingresso dello spermatozoo (porzione ventrale) e dall’altra la parte che determina il destino dorsale dell’embrione che contiene fattori dorsalizzanti. Le due metà riescono a svilupparsi in embrioni più o meno vitali. La porzione dorsale dà sviluppo a un embrione che perde tutte le strutture dorsali → embrione ventralizzato. Nella metà dorsale si sviluppa un embrione molto simile a un embrione normale che perde parte delle strutture che derivano dal polo ventrale → embrione dorsalizzato. Da questo esperimento si deduce che nella porzione dorsale sono presenti fattori dorsalizzanti fondamentali per lo sviluppo embrionale.

Proteine WNT

Le proteine della famiglia WNT sono glicoproteine secrete (possono comunicare con cellule distanti) che attivano molti processi cellulari e di sviluppo. Le proteine WNT sono conservate in tutti i metazoi, nei mammiferi la complessità di segnale è ottenuta con l’utilizzo di 19 ligandi WNT. I ligandi di WNT sono proteine ricche di cisteine di circa 350-400 aa con un dominio N-terminale glicosilato per la secrezione. In aggiunta alla glicosilazione all’N terminale, le proteine WNT vengono palmitolate (possono essere incluse in vescicole → migrano molto distante). Le proteine WNT possono agire con interazioni a breve o lunga distanza unendosi con particelle lipoproteiche per il trafficking intracellulare.

Essendoci numerosi ligandi in questa via significa che la via è importante e deve essere finemente regolata → per far funzionare la via in luoghi diversi cambio il ligando. La via è molto conservata e questo significa che è una via fondamentale.

I recettori di WNT sono la proteina transmembrana Frizzled e le proteine LRP5 e LRP6 che agiscono entrambe durante la gastrulazione, la forma preponderante durante l’embriogenesi è la LRP6 mentre quella dell’adulto per l’omeostasi ossea è la LRP5. La palmitolazione di WNT serve proprio per il legame con i recettori.

La via di segnalazione si chiama WNT/ -catenina perché questa è l’effettore finale nucleare, è una via di segnalazione canonica, molto frequentemente queste vie di segnalazioni importanti esistono anche in forma non canonica.

Pathway off

Quando non c’è stimolazione, i recettori di membrana non dimerizzano. Nello stato inattivo la -catenina viene sequestrata dal complesso di proteine contenente:

• Axin
• APC: è uno dei geni più frequentemente mutati nel tumore al colon
• GSK3
• CKI

La -cat viene fosforilata da CKI e GSK3 in sequenza su varie serine e smaschera siti di legame per una ubiquitina-ligasi che la ubiquitina e la degrada nel proteasoma. I geni responsivi al WNT pathway rimangono silenziati anche perché c’è un complesso che li reprime.

C’è un grande cross talk che serve ad avere una regolazione veloce ed efficiente.

Pathway on

Il legame di WNT con i recettori LRP5/6 e Frizzled li fa dimerizzare e attiva il reclutamento di Dishvelled, la fosforilazione di LRP6 da parte di GSK3 e il reclutamento di Axin che non legherà più -catenina. La -catenina non più sequestrata dal complesso di Axin, si accumula nel citoplasma, trasloca nel nucleo e attiva i geni responsivi di WNT → TCF/LEF.

Inibitori

Molte molecole servono per modulare il pathway di WNT chiamate Secreted-Frizzled related proteins (SFRP) e WNT inhibitory factors (WIF) che si legano sia a WNT sia a Frizzled inibendo la trasduzione del segnale.

Proteine della famiglia Dikkopf (DKK) e WISE/SOST si legano al recettore LRP5/6 e lo distruggono.

Proteine della famiglia Shisa agiscono sul recettore Frizzled sequestrandolo nel reticolo endoplasmatico non facendolo traslocare in membrana.

Attivatori

Esistono anche molecole attivatori di WNT come le proteine che interagiscono con LRP5/6 e Frizzled e le proteine Norrin che interagiscono con Frizzled4.

Target

I fattori trascrizionali della famiglia TCF/LEF sono i partners principali della -cat nucleare. I TCF reprimono l’espressione genica interagendo con il repressore Groucho (TLE1 in uomo), che promuove acetilazione istonica e compattazione della cromatina. Il complesso TCF/ -cat sposta Groucho e attiva la trascrizione genica.

Mutazioni

Ci sono molte patologie correlate a questa via di segnalazione, possiamo avere mutazioni in vari punti → ligandi, recettore, componenti del complesso, cat. I tipi di patologia possono essere diversi: schizofrenia, leucemia, fibrosi polmonare, tanti tipi di tumori. Posso avere mutazioni loss o gain of function.

Sindrome di Cornelia de Lange

È una malattia genetica multisistemica che determina numerosi difetti come dismorfismo facciale, difetti agli arti superiori e inferiori (dita tozze con arti molto corti), difetti cardiaci o gastrointestinali e un grave ritardo mentale. L’incidenza è di 1 soggetto ogni 10.000-50.000 e non c’è differenza né di sesso né di etnia. La patologia è data da mutazioni in una serie di geni diversi che fanno tutti parte del complesso delle coesine. Le mutazioni sono sporadiche quindi si presentano raramente e non presentano caratteristiche in comune. Il gene più frequentemente mutato (50/60% dei casi) è il NIPBL, sul cromosoma 5 dell’uomo, e la sua mutazione è autosomica dominante. Gli altri geni che sono mutati in meno casi sono due geni sul cromosoma X (SMC1A e HDAC8) e poi SMC3 e RAD21.

Complesso delle coesine

Le proteine normalmente formano il complesso delle coesine → struttura ad anello che abbraccia la doppia elica del DNA. I componenti principali sono...