Biochimica molecolare

Biochimica molecolare

Acido nucleico

Cellula batterica → Il DNA è più piccolo rispetto a quello che si trova nella cellula eucariotica. Il DNA si filamento di materiale genetico. Dentro al batterio c’è poi trova disperso nella cellula (nucleoide→ ciò che serve al nucleoide per formarsi e duplicarsi.

Cellula eucariotica → DNA molto più grande, lungo. Il DNA si trova all’interno del nucleo, ci sono dei pori sulla membrana nucleare da cui riesce a passare solo un filamento singolo, non la doppia elica (è tridimensionalmente più grande)→ non può uscire il DNA perché è troppo prezioso e non può essere perso degradato (ci sono enzimi nel citoplasma che degradano DNA esogeno, DNAasi → possono andare a degradare anche il DNA della cellula stessa. Ci sono delle DNAasi anche nel nucleo che servono nel caso in cui ci sia da rompere e ricostruire una parte di filamento che è stata costruita male), quindi esce solo l’RNA. Ha un sistema di passaggio selettivo.

Vaccini a DNA

Si formano piccoli fiocchi che riescono a entrare nel nucleo, ma non si inseriscono nella nostra catena di DNA, non modificano il nostro DNA, restano in forma episomale (distaccata dal nostro DNA), verranno letti dagli enzimi per fare RNA insieme al nostro DNA (si comportano come plasmidi → es. insulina ricombinante, viene fatta produrre dai batteri inserendo i plasmidi).

DNA del mitocondrio è diverso dal DNA nucleare e ribosomiale. Nel primo è più simile a quello batterico, è circolare (teoria endosimbiontica). Nei secondi è lineare.

RNA e sue funzioni

Esistono RNA a corta sequenza (miRNA, siRNA) sparsi nel citoplasma che servono per controllare il metabolismo, hanno delle sequenze che si appaiono a degli enzimi, ad altri pezzi di RNA e controllano ciò che viene trascritto. Stanno diventando dei marcatori diagnostici.

Ci sono enzimi che mantengono i filamenti di DNA compatti così che possano rientrare all’interno dei propri compartimenti. L'RNA che esce dal nucleo deve andare ai ribosomi, e questi sono appoggiati sul reticolo endoplasmatico sia con l’apparato di Golgi sia con il nucleo → che è in continuità. Sono dei sistemi di membrane che, quando la proteina è prodotta, la indirizzano al bersaglio giusto tramite sistemi vescicolari e la modificano (ad esempio se deve coniugarsi con un lipide a formare una lipoproteina). La compartimentalizzazione della cellula è importante, si fronteggiano apparati che comunicano e lavorano insieme.

Storia della scoperta del DNA

DNA era stato notato che c’era qualcosa che veniva È stato isolato e caratterizzato nel 1868 da Miescher → di “similarità” tra cellule (es. padre-figlio) → trasmesso, che passava informazioni il fattore trasformante era stato identificato con la nucleina → Miescher individuò dei composti a base di C, O, N e P (4 elementi che compongono l’elica del DNA) e li chiamò appunto nucleina (era una componente che aggregava insieme durante i processamenti chimici, si allontanava dagli altri componenti della cellula). Poi più avanti grazie a vari esperimenti fu scoperto che il fattore trasformante era il DNA.

Esperimento di Griffith (1928)

Prese un batterio che portava a polmonite → pneumococco.

• Un batterio S (smooth, liscio) rivestito da capsula che proteggeva il materiale genetico, è virulento, non viene attaccato dal sistema immunitario.
• Un batterio R (rough, rugoso) senza la capsula (ma con DNA, proteine uguali al ceppo S) → viene attaccato dal sistema immunitario, non è virulento.

Inoculò nei topi:

• Solo il ceppo R → controllo, il topo rimane in salute
• Solo il ceppo S → virulento, il topo si ammala e muore
• Il ceppo S inattivato al calore (DNA degradato) → il topo rimane in salute
• Il ceppo S inattivato al calore + il ceppo R → il topo si ammala e muore. Dal ceppo S qualcosa passava al ceppo R o viceversa → la capsula del ceppo S viene colonizzata dal DNA del ceppo R e lo rende virulento → fattore di trasformazione. Ancora non sapevano che fosse DNA.

Esperimento di Avery (1943)

Anche in questo caso viene usato un batterio che portava a polmonite, in particolare viene usato il ceppo S lisato. Trattò diverse aliquote di ceppi S lisati con enzimi che rompono cose diverse (RNAasi, proteasi, DNAasi, lipasi e carboasi). Unì il preparato degradato di S (dopo l’azione dell’enzima) + il ceppo R → solo con le DNAasi non c’era il ceppo S virulento (nel resto dei casi ritrovava sempre il ceppo S virulento → avveniva il processo di trasformazione con il ceppo R). Da qui si scoprì che il DNA è ciò che fa avvenire la trasformazione.

Nel 1953 Hershey-Chase dimostrarono che il materiale genetico è costituito dal DNA.

Tipi di RNA e loro ruolo

RNA → È una molecola di regolazione durante la trascrizione, agisce come regolatore sul metabolismo del DNA, ma anche nella traduzione.

• mRNA → sono prodotti nel momento in cui servono → presenza temporale (come le proteine). Esistono tantissimi diversi tipi. Trascrive l’informazione, è il passaggio da DNA a proteine.
• rRNA → RNA avvolti a formare i ribosomi (RNA compatti), hanno un sistema di apri e chiudi (tipo tenaglia) → fanno entrare mRNA e hanno un sito di riconoscimento che si lega al tRNA e quando due aa sono vicini avviene la reazione, esce acqua e si forma il legame amminoacidico. I ribosomi sono la macchina per creare proteine.
• tRNA → transfert, è a forma di quadrifoglio. Trasportano amminoacidi, sono legati ad aa (tRNA specifici per ogni amminoacido + altre copie per un trasporto più veloce per gli amminoacidi più utilizzati, devono essere in grandi quantità nelle proteine). Hanno una doppia funzione: riconoscono il messaggio dell’mRNA alla base e all’apice legano l’amminoacido, la proteina.
• miRNA → microRNA, usato per la diagnostica (nella cellula hanno funzione di controllo delle reazioni metaboliche degli acidi nucleici, stimolano la produzione, o rallentano/velocizzano la trascrizione. Si trovano in grande quantità e quindi li ritroviamo nel sangue) o come farmaco (interferisce con la sintesi di alcune proteine (es. per il trattamento dei sintomi della SLA)).
• siRNA → silencingRNA, silenzia le proteine, blocca la trascrizione di certe proteine. Non le fa legare le catene con i ribosomi e così non viene prodotta la proteina.
• shRNA → shortRNA, primer di innesco per la trascrizione, intervengono nel metabolismo della ricostruzione del DNA, che può essere stato copiato male.

Esistono RNA con funzione catalitica (funge da enzima) (ipotesi che la prima vita sul pianeta fosse a RNA). Spesso l’RNA viene sfruttato anche per fare altri studi (al contrario del DNA) → es. rRNA studiato per studiare la ricostruzione della “distanza” tra diverse specie.

Composizione cellulare e nucleotidi

Ogni parte della cellula è formata da cose diverse. RNA e DNA sono macromolecole, sono di grandi dimensioni, e sono formati da nucleotidi che derivano da tre categorie chimiche diverse: basi azotate (con vie di sintesi diverse e vie di escrezione), zucchero (ribosio o desossiribosio → la mancanza di quell’ossigeno permette agli enzimi di riconoscere DNA dall’RNA) e fosfato. Le basi azotate sono di due tipi: a singolo anello (pirimidine→ uracile, timina e citosina) o a due cicli (purine → guanina e adenina). Si formano dei filamenti che nel DNA si accoppiano a formare una struttura a doppia elica (a seconda di come è fatta l’elica ha funzioni diverse, di solito l’elica è un po’ allungata e asimmetrica).

Proprietà e duplicazione del DNA

La proprietà più importante del DNA è la duplicazione → da una singola elica ne ottengo due quando vado incontro al processo di duplicazione (per fare cellule figlie o per rigenerare il tessuto che è andato incontro a lesioni → es. fegato). Se la duplicazione è troppo veloce (incontrollata) si formano i tumori (→ chemioterapici bloccano questa funzione, si sostituiscono, prendono il posto dei nucleotidi e bloccano il meccanismo). Le altre due proprietà sono la trascrizione e la traduzione. Nella trascrizione trascrivo il gene di mio interesse, lo trascrivo da DNA a RNA, nella traduzione traduco la catena di RNA in proteina.

L’esochinasi è il primo enzima della glicolisi, il primo passaggio prevede la fosforilazione del glucosio → l’esochinasi è una proteina con caratteristiche catalitiche, avvicina glucosio e ATP che cede un gruppo fosfato al glucosio (glucosio 6-fosfato che viene liberato) e si trasforma in ADP. Sul nostro DNA c’è un pezzo che si chiama gene dell’esochinasi che permette la sintesi dell’enzima (sintesi presente se ingeriamo glucosio, altrimenti viene inibita quasi completamente perché manca il substrato su cui agisce).

Grazie al pH e all’ambiente acquoso, le cariche degli aa dell’esochinasi si orientano a formare la struttura tridimensionale della proteina (ad esempio se siamo in pH acido, espongono all’esterno le catene R caricate negativamente per compensare le cariche positive degli ioni nell’ambiente acquoso).

Mutazioni e RNA autoreplicante

Durante la duplicazione si possono avere degli errori che portano a mutazioni. Esistono mutazioni a senso negativo che portano a patologie (viene prodotta una proteina mutata oppure non viene proprio prodotta) (es. SLA (mutazione a livello della SOD), Alzheimer familiare) oppure a senso positivo che portano a conseguenze positive (es. gene dell’esochinasi duplicato → ci sono due geni che fanno la stessa cosa, poi si ha una mutazione sul gene duplicato (cambio di nucleotidi, mutazione puntiforme, ad esempio da CGT a CCT si forma un aa diverso che può portare a perdita del sito attivo oppure riesce a migliorare la situazione perché riesce a legare un altro tipo di zucchero, il galattosio)).

Esistono RNA con capacità di autoreplicazione, autosufficienti (sono enzimi catalitici) → per questo ipotesi che la prima molecola di vita sulla terra fosse a RNA. Riescono ad abbassare l’energia di formazione. Poi l’RNA per essere protetto e conservato in maniera più sicura si è evoluto in DNA, la doppia elica è più stabile.

DNA e adattabilità

Più il DNA è grande, maggiore è il numero di proteine che possono essere codificate → pianta giapponese ha il DNA più grande, ha bisogno di poter produrre proteine per adattarsi a tutte le situazioni, non può muoversi (noi non riusciamo ad adattarci bene all’ambiente).

DNA mitocondriale

L’altro DNA fondamentale è quello mitocondriale (oltre a quello nucleare) → ci sono geni che codificano per proteine che servono per lo più al mitocondrio stesso (es. per la regolazione della fosforilazione ossidativa → via finale a cui arrivano gli elettroni (dalle reazioni di ossidoriduzione) che permettono la formazione dell’ATP, subunità enzimatiche della catena respiratoria, per tRNA, mRNA e rRNA e l’ATPsintasi). Il mitocondrio era un batterio per questo ha i geni per codificare per le proprie proteine.

Esistono anche dei passaggi tra nucleo e mitocondrio. Esistono mitocondri diversi a seconda della necessità della cellula (se necessitano di più ATP o ad esempio di produrre più ormoni steroidei).

Patologie mitocondriali

MERF → disturbo muscolare, si ha una mutazione a livello del gene 8344A>G (A è diventato G, così si intende a livello di DNA, se è scritto A8344G si intende a livello della proteina. Stessa differenza c’è nel DNA se è scritto minuscolo corsivo parlo del gene, se è scritto maiuscolo parlo della proteina) che codifica per il tRNA della lisina, e si ha una difficoltà di contrazione del muscolo, i muscoli non hanno abbastanza ATP per avere una contrazione efficace. Anche le mutazioni a livello mitocondriale hanno conseguenze su tutto l’organismo. Molte mutazioni a livello mitocondriale portano a patologie neurologiche (es. corea (disturbo neurologico in cui i pazienti hanno impulsi spasmodici improvvisi continui), atassia).

Per ogni mitocondrio abbiamo circa 10 copie di DNA → abbiamo 1000-10000 copie di DNA mitocondriale all’interno della cellula (→ per questo è stato usato questo per studiare la paleogenetica, studio del genoma dei nostri predecessori. Homo sapiens e di Neanderthal hanno convissuto). Si sono conservate 7 tipologie diverse di DNA mitocondriale, trasferite dalla madre (lo spermatozoo trasporta solo DNA nucleare).

Eteroplasmia

Nel DNA mitocondriale ci sono anche mutazioni che portano a patologie (donna portatrice sana (DNA mitocondriale portato con l’ovulo), uomo malato). Eteroplasmia → all’interno della stessa cellula (nucleare e mitocondriale, ma anche diverso tra i diversi mitocondri nella stessa cellula), di quello mitocondriale ci possono essere delle mutazioni → in alcuni mitocondri si hanno delle mutazioni (mitocondri mutanti/mitocondri normali). Con la duplicazione vengono duplicati anche i mitocondri mutanti che poi si spartiscono in maniera casuale nelle cellule figlie → nella seconda generazione posso avere cellule che non presentano più mitocondri mutanti e ho omoplasmia, oppure avere cellule con solo mitocondri mutanti e sono quindi cellule malate.

Struttura dei nucleotidi

I nucleotidi sono strutture chimiche formate da carbonio, azoto e idrogeno. Sono costituiti da uno zucchero, una base azotata e gruppi fosfato (da 1 a3 → mono, di o trifosfato). Il nucleoside è formato solo dalla base e dallo zucchero. Es. ATP → adenosina trifosfato. L’ATP è il modulatore per gli enzimi del ciclo di Krebs (se c’è tanto ATP non c’è bisogno di continuare il ciclo per produrne ancora → perciò viene interrotto. Al contrario se c’è tanto ADP). Questa è la regolazione metabolica (fatta da piccole molecole, piccoli metaboliti → prodotti durante il metabolismo). L’altro tipo di regolazione è quella ormonale (es. sulla glicolisi la regolazione è dovuta all’insulina).

Produzione del DNA

Le vie deputate a produrre le strutture base del DNA sono le vie delle basi azotate (sia di sintesi sia di degradazione) (sono vie metaboliche). Si parte da aa, CO2 e folati (ecco perché sono importanti durante la gravidanza e nei casi di malattie). L’altra via essenziale per creare i nucleotidi è la via del pentosio fosfato → seconda via di ossidazione del glucosio (la prima è la glicolisi). Il glucosio viene assorbito a livello intestinale e se serve viene usato dalle cellule per la glicolisi, se c’è già tanta energia si attiva la seconda via, quella dei pentosi fosfato → serve per ottenere zuccheri pentosi a partire dal glucosio che è uno zucchero esoso. Esistono dei segnalatori tra cui lo stato energetico della cellula (dovuta alla presenza del NADP) che indicano quale via metabolica seguire al glucosio. Il NAD è un dinucleotide.

È importante la numerazione dei carboni per capire il verso di percorrenza dovuto alle estremità 5’ o 3’ → alcuni enzimi lavorano solo in un verso. La base azotata è legata in posizione 1’, il gruppo fosfato a livello della posizione 5’. Legame beta-glicosidico della base azotata con lo zucchero. La posizione 2’ dello zucchero è importante per differenziare tra DNA e RNA.

Conformazioni del DNA

Esistono delle conformazioni dovute al fatto che la base può ruotare rispetto allo zucchero → conformazione SIN o ANTI. È importante perché a seconda dell’orientamento delle basi cambia la struttura del DNA → si deforma. Nella maggior parte abbiamo la conformazione ANTI, esiste un DNA, il DNA Z (zig-zag) che presenta alternate delle basi azotate in posizione SIN → conformazione instabile → c’è l’ingombro sterico dell’ossigeno con ciò che sta sopra di questo (isolato soprattutto in presenza di forte disidratazione).

Legame fosfoestereo → zucchero al fosfato, legame anidridico → tra i gruppi fosfati (oltre a quello beta-glicosidico). Se c’è la “d” vuol dire che c’è un ossigeno mancante → deossiribonucleotidi (gli altri sono ribonucleotidi). dAMP → deossiadenosinamonofosfato (o dA → deossiadenosina), AMP → adenosinamonofosfato. Ribonucleotide reduttasi → enzima che trasforma i ribonucleotidi in deossiribonucleotidi.

Quantificazione dei ribonucleotidi

Per studiare la quantità di ribonucleotidi in una miscela si va a sfruttare la loro diversa assorbanza → assorbono a lunghezze diverse e a picchi diversi. Ciò dipende dal fatto che c’è un salto elettronico → quando torna dallo stato eccitato a quello fondamentale emettono luce. Le basi hanno tantissimi doppi legami e quando sono bombardati si muovono e assorbono la luce → fanno dei movimenti elettronici, perciò, hanno lunghezze d’onda in cui si vede il coefficiente di assorbimento. Si usano questi picchi per la quantificazione del DNA. Si sfrutta lo spettrofotometro nell’UV → darà dei picchi e a seconda dell’altezza e della lunghezza posso risalire alla concentrazione.

Ci sono basi che non sono usate nel DNA ma sono usate per altri scopi → basi minori, servono a rendere possibile il metabolismo delle basi, fungono da intermedi per le basi principali (es. N-metiladenosina → tipica dei batteri). I nucleotidi hanno anche un’altra funzione oltre a segnalazione, RNA e DNA → sono una riserva energetica, l’idrolisi dei nucleotidi trifosfato costituisce una fonte di energia chimica per guidare un gran numero di reazioni biochimiche (legame ad alta energia). Sono anche precursori per i coenzimi, FAD, NAD. Sono molecole regolatrici → sono messaggeri (proteine G, es. AMPc e GMPc come secondi messaggeri).