Biochimica avanzata

Appunti di biochimica avanzata anno accademico 2022/2023

Ripasso proteine

Le proteine sono macromolecole formate da almeno 50-60 amminoacidi e con un peso molecolare di minimo 6000 Dalton (per le proteine piccole). Ogni proteina ha una sua sequenza di amminoacidi specifica che varia in numero e in ordine con il quale gli amminoacidi si susseguono: l'ordine determinerà anche la struttura della proteina. Le proteine non hanno una grande stabilità: possono perdere la loro struttura se riscaldate anche a temperature molto blande (tipo 50°C). Anche la stabilità dipende dall'ordine degli amminoacidi. In ogni caso, la proteina deve essere flessibile e non perfettamente stabile in quanto deve essere in grado di modificare leggermente la propria conformazione per poter funzionare (es. ligando che lega l'enzima ed enzima che, per funzionare, cambia la sua conformazione).

I componenti delle proteine sono gli amminoacidi, caratterizzati da un gruppo amminico, un gruppo carbossilico e una catena laterale (che permette di distinguere i vari amminoacidi tra loro e conferisce loro diverse caratteristiche):

• Catena laterale alifatica: Gly, Ala, Pro, Val, Leu, IsoLeu e Met. Hanno la catena laterale con una sequenza di atomi di C. Possono essere idrofobici (specialmente quelli che hanno una catena laterale molto lunga), ma anche idrofilici (Gly e Ala).
• Catena laterale polare: Ser, Threo, Cys, Asn e Gln. Hanno catene laterali polari in cui sono presenti legami chimici dove la carica è spostata verso l'atomo più elettronegativo. Asn (Asparagina) e Gln (Glutammina) sono le ammidi dei corrispettivi amminoacidi acidi (Asp e Glu); nelle ammidi l'ossidrile del carbossile della catena laterale è sostituito da un gruppo amminico (che è un gruppo polare).
• Catena laterale carica positivamente: Lys, Arg e His. Sono amminoacidi basici con la catena laterale che porta una carica positiva.
• Catena laterale carica negativamente: Asp e Glu. Sono amminoacidi acidi con la catena laterale che porta una carica negativa.
• Catena laterale aromatica: Phe, Tyr e Trp. Sono idrofobici perché i gruppi aromatici non hanno caratteristiche di solubilità e sono molto ingombranti.

Le proteine sono tenute insieme da legami peptidici che si formano tra il gruppo COOH (carbossilico) del primo AA e il gruppo NH₂ (amminico) dell'AA successivo, con eliminazione di una molecola d'acqua. Dunque, la catena peptidica parte con un gruppo NH₂ libero e termina con un gruppo COOH libero. La sequenza amminoacidica determina la struttura primaria della proteina, che è la struttura più stabile (in quanto è stabilizzata da legami peptidici, che sono legami covalenti).

Nella struttura secondaria e terziaria intervengono legami più deboli (legami a H o interazioni elettrostatiche e idrofobiche), dunque sono strutture meno stabili. La struttura secondaria riguarda porzioni della catena peptidica ed è caratterizzata da una serie di ripiegamenti ad α-elica o a foglietto-β, strutture stabilizzate dalla presenza di legami a H che si instaurano tra l'H del gruppo NH₂ di un legame peptidico con l'O del COOH di un altro legame peptidico. Il legame a H è meno stabile del legame peptidico ma comunque più stabile di altri tipi di legame (es. interazioni idrofobiche), dunque se c'è un'alta percentuale di struttura secondaria, la proteina è termostabile. Nella struttura ad α-elica i legami a H si instaurano tra un amminoacido e quello 4 amminoacidi più avanti. Nella struttura a foglietto-β si ha la formazione di più legami a H tra amminoacidi di tratti diversi (posti parallelamente tra loro) dello stesso polipeptide; le catene laterali degli amminoacidi si estendono al di sopra e al di sotto del piano mediano del foglietto, risultando poco distanziati tra loro (per questo tale struttura si trova di preferenza in proteine con residui poco voluminosi). La struttura foglietto-β può essere antiparallela (i legami a H che si formano sono planari e questo fa sì che l'energia di legame sia più elevata e la struttura più stabile) o parallela (si formano legami meno forti, quindi la struttura è meno stabile).

Nella struttura terziaria si hanno ulteriori ripiegamenti stabilizzati da legami deboli (interazioni elettrostatiche tra catene laterali polari o interazioni idrofobiche tra catene laterali lipofile). La struttura terziaria fa sì che all'interno della proteina vadano ad inserirsi AA idrofobici e all'esterno AA con catene polari o provviste di carica (dunque, idrofiliche e che possono interagire con l'ambiente acquoso). Nella struttura terziaria sono presenti anche delle random coil, eliche casuali che contribuiscono alla stabilità della struttura e interagiscono tra loro con legami deboli. Le proteine possono avere uno o più domini: un dominio è una zona della proteina che si organizza strutturalmente in maniera autonoma. I vari domini di una proteina sono indipendenti e svolgono funzioni diverse o possono collaborare ai fini di permettere la funzionalità della proteina stessa. Es. piruvato chinasi ha 3 domini: uno che lega il ligando, uno catalitico e uno regolatore. In genere, le proteine multidominio caratterizzano il mondo degli eucarioti, mentre quelle monodominio sono caratteristiche dei procarioti.

Nella struttura quaternaria, caratteristica solo di alcune proteine, si ha un'associazione di più catene polipeptidiche, ciascuna dotata di una propria struttura terziaria e in grado di organizzarsi in modo indipendente. I legami della struttura quaternaria sono comunque legami deboli ma che stabilizzano la struttura. Es. di proteina con struttura quaternaria: Emoglobina.

Il 30% delle proteine codificate dal nostro genoma si trovano nelle membrane plasmatiche e sono caratterizzate dalla presenza di porzioni idrofobiche transmembrana ad α-elica (particolarmente adatte in ambiente idrofobico, in quanto i residui idrofobici interagiscono con i fosfolipidi di membrana) e delle porzioni idrofiliche che sporgono dalla membrana e che si trovano bene in ambiente acquoso (formano legami deboli con l'acqua). Questi legami con i fosfolipidi di membrana e l'ambiente acquoso stabilizzano la struttura della proteina nel suo ambiente. Le proteine transmembrana vengono trascritte, poi tradotte a livello dei ribosomi presenti sulla membrana del RE e poi possono essere trasportate sul Golgi (dove assumono il giusto ripiegamento) per poi essere trasportate sulla membrana plasmatica (o direttamente o attraverso una vescicola che si fonderà con la membrana).

Carboidrati

I carboidrati sono sostanze formate da carbonio ed acqua, possono essere semplici o complessi e sono classificati in:

• Monosaccaridi: formati da un singolo monomero (glucosio, fruttosio, ecc.)
• Disaccaridi: formati dall'unione di due monosaccaridi (saccarosio, maltosio, ecc.)
• Oligosaccaridi/Polisaccaridi: formati da tre o più monosaccaridi.

Esistono centinaia di monosaccaridi che si differenziano per il numero di atomi di C ma quelli a 6 C sono i più importanti per noi dal punto di vista nutrizionale. Una importante fonte di accumulo energetico di carboidrati negli animali è rappresentata dal glicogeno, un omopolimero ramificato di molecole di glucosio tenuto insieme da legami di tipo α-1,4-glicosidici e α-1,6-glicosidici (nei punti di ramificazione).

Lipidi

I lipidi sono costituiti prevalentemente da atomi di C e H, e legami covalenti. Esistono due principali categorie di lipidi:

• Lipidi neutri (apolari): sono lipidi totalmente idrofobici. Es. trigliceridi (o triacilgliceroli) formati da un glicerolo (alcol trivalente con 3 gruppi OH e con 3 C) i cui gruppi OH sono legati ciascuno, attraverso un legame estere, a un gruppo carbossilico di un acido grasso (formato da un gruppo COOH legato a una catena alifatica abbastanza lunga formata da soli C legati a H). È una molecola completamente idrofobica: dunque tanti trigliceridi si uniscono tra loro formando gocce/micelle in cui verso l'esterno sono presenti le teste di glicerolo e verso l'interno le code di acidi grassi. Nel tessuto adiposo troviamo gli adipociti con citoplasma limitato alla periferia e trigliceridi presenti all'interno di una grande goccia o tante piccole gocce lipidiche. Il tessuto adiposo è la sede di deposito dei trigliceridi (lipogenesi) e la mobilitazione di questi ultimi (lipolisi) serve a livello sistemico, in quanto libera molta energia che serve al metabolismo generale. A temperatura ambiente lo stato fisico dei trigliceridi dà luogo agli oli, in cui prevalgono acidi grassi insaturi (con più doppi legami). Nei grassi animali invece prevalgono le catene carboniose semplici, senza doppi legami (acidi grassi saturi). I lipidi neutri sono, quindi, lipidi di deposito che si formano quando abbondano le riserve energetiche nell'organismo.
• Lipidi polari: sono lipidi in cui sono presenti gruppi funzionali che hanno una certa affinità con l'ambiente acquoso, spesso gruppi OH. Sono più abbondanti nell'organismo rispetto a quelli neutri perché compongono le membrane biologiche. Es. I fosfolipidi sono molecole di natura lipidica formate da un glicerolo in cui 2 dei 3 gruppi OH sono esterificati ciascuno con un acido grasso, mentre il terzo OH viene esterificato con un fosfato inorganico (che è un acido provvisto di carica negativa, con tre gradi di protonazione). Il fosfogliceride (fosfolipide) più semplice è l'acido fosfatidico (glicerolo esterificato con due gruppi COOH e un fosfato), che esiste nelle membrane biologiche come intermedio che porta alla formazione di fosfogliceridi più complessi; può subire una reazione di coniugazione con un alcol o un'altra molecola polare, può legarsi ad una colina, serina o ad un'etanolammina. La fosfatidilcolina è il fosfolipide di membrana più rappresentato (la colina è un ammide terziaria). Il fosfatidilinositolo è un fosfolipide contenente un inositolo (polialcol a 6C con un gruppo OH legato a ciascun C). Queste molecole si orientano sia in ambiente idrofilico (per via della testa polare legata a gruppi funzionali dotati di carica) sia in ambiente idrofobico (per via degli acidi grassi), sono dunque molecole anfipatiche.

Colesterolo (struttura da sapere bene): molecola dotata di una struttura a 27 C, organizzati in anelli con una catena alifatica, a cui sono legati solo atomi di H (tranne al C3 in cui è presente un gruppo OH, che permette di formare un legame con l'acqua). Il colesterolo può stare in ambiente idrofilico o idrofobico, grazie alla sua struttura. Con gli anelli e la coda si intercala nelle membrane biologiche e con il gruppo OH si può orientare verso le parti esterne della membrana (sia a livello intra che extra-cellulare): infatti è una molecola molto presente nelle membrane degli eucarioti. Se il colesterolo subisce una reazione di esterificazione (grazie al suo gruppo OH) con un acido grasso, si ottiene un estere del colesterolo che non è polare. Il colesterolo si può accumulare ed essere dannoso in quanto altera la fluidità delle membrane. Se però il colesterolo viene esterificato, si comporta come un trigliceride, si deposita in gocce e non è più pericoloso.

Anabolismo

Anabolismo: riguarda processi biosintetici che avvengono nella cellula e che richiedono energia (ATP) per poter effettuare delle reazioni che altrimenti sarebbero termodinamicamente sfavorite. Si tratta di processi di riduzione. Es. Biosintesi degli acidi grassi: un acido grasso è un acido carbossilico con una catena R in genere molto lunga e formata da atomi di C che sono interamente ridotti (tranne il C del carbossile). Si sintetizzano nelle cellule a partire dall'Acetil-CoA (costituito da un metile e un carbonile con C massimamente ossidato e legato al CoA). Il primo intermedio che si forma è un composto dove un atomo di C (che deriva dal carbossile) è in una forma meno ossidata (sotto forma di carbonile C=O). Durante la biosintesi abbiamo l'aggiunta di una molecola di H₂O, con la riduzione del legame C-O. Seguono ulteriori riduzioni che richiedono ATP e la presenza di coenzimi ridotti. L'Acetil-CoA usato per la sintesi degli acidi grassi viene prodotto nei mitocondri da:

• L'ossidazione del piruvato: il glucosio viene trasformato in piruvato con la glicolisi. Il piruvato entra nei mitocondri, subisce una decarbossilazione (da 3C a 2C) e diventa Acetil-CoA.
• Dal catabolismo degli AA.

Catabolismo

Catabolismo: produce energia sotto forma di ATP rompendo molecole più grandi (polimeri) in molecole più piccole (monomeri). Sono processi energeticamente favoriti. La produzione di ATP garantisce che possano essere svolti in parallelo le reazioni anaboliche. Si tratta di processi di ossidazione, in cui gli atomi di C passano da uno stato di ossidazione massimamente ridotto (legati a H) ad uno stato di ossidazione massimamente ossidato (CO₂), grazie ad enzimi specifici chiamati deidrogenasi. La produzione di CO₂ sarà fondamentale per alimentare la catena respiratoria, che prevede un trasporto di elettroni e protoni nel mitocondrio grazie alla presenza di coenzimi ridotti (come NADH). Gli elettroni e i protoni vengono passati da un coenzima ossidato ad uno ridotto che, ossidandosi, potrà a sua volta trasferirli ad un altro coenzima ridotto, fino ad arrivare all'accettore finale (O₂) che si prenderà protoni ed elettroni e formerà una molecola di H₂O.

Ciclo dell'acido citrico (o ciclo di Krebs): è un ciclo di ossidazione dove confluiscono metaboliti che appartengono alle principali biomolecole (proteine, acidi grassi, glicogeno e glicerolo), portando alla formazione di Acetil-CoA. Quando l'Acetil-CoA condensa con l'ossalacetato (4C), si ottiene il citrato (6C) che va incontro a processo ossidativo. I substrati vengono ossidati e rilasciati sotto forma di CO₂, si consuma NAD e FAD e si ottiene Acetil-CoA. Dunque, questo ciclo porta all'ossidazione di 2C appartenenti all'Acetil-CoA a CO₂. Queste reazioni permettono la riduzione di coenzimi piridinici e la produzione di GTP.

Per la produzione di ATP: dipende dall'ATP-sintasi. Durante la catena respiratoria si accumulano protoni ad un lato della membrana; questo forma un gradiente in grado di generare una forza motrice che viene sfruttata dall'ATP-sintasi per la formazione del legame ADP-Pi, per la formazione di ATP.

Ci sono vie metaboliche comuni a tutte le cellule di ogni tessuto umano, ma ci possono essere anche specializzazioni (ovvero, vie metaboliche tipiche solo di alcuni tessuti) es. gluconeogenesi è un processo esclusivo del fegato. NB. Gluconeogenesi è un processo di biosintesi di glucosio a partire da molecole che non derivano da carboidrati, ad esempio: glicerolo (deriva dal catabolismo dei trigliceridi), acido piruvico (che deriva dalla scissione delle proteine che, private del gruppo NH₂, si trasformano in piruvato).

Enzimi

Le reazioni avvengono grazie a enzimi, catalizzatori biologici che non alterano l'equilibrio delle reazioni tra reagenti e prodotti ma la velocizzano. Gli enzimi sono proteine dotate di struttura terziaria, talvolta quaternaria, e grazie alla loro struttura sono capaci di interagire con determinati ligandi (substrati). L'enzima, infatti, ha una zona specifica di legame con il substrato; questo legame porta ad un cambiamento di conformazione dell'enzima che permetterà la trasformazione del reagente in prodotto. Gli enzimi possono essere regolatori delle vie metaboliche per determinare la quantità di metaboliti che fluiscono a livello della via metabolica nell'unità di tempo.

Cinetica enzimatica

La finalità dell'enzima è quello di accelerare reazioni che altrimenti ci metterebbero troppo tempo per compiersi. Per valutare la cinetica enzimatica, possiamo andare a vedere come varia la velocità di reazione all'aumentare della concentrazione del substrato. Riportando i valori su un grafico dovremmo ottenere un'iperbole equilatera in cui si ha l'aumento della velocità di reazione all'aumentare della quantità di substrato fornita, fino ad un certo punto di saturazione (Vmax) in cui tutti gli enzimi sono occupati e all'aumentare del substrato non si avrà più l'aumento della velocità di reazione (cinetica di Michaelis-Menten). Da questo grafico possiamo ottenere anche una Km, ovvero la concentrazione di substrato che devo avere per raggiungere esattamente metà della velocità massima; è un indice di affinità (più alta è la Km e minore è l'affinità e la velocità di reazione, e viceversa). NB. Gli enzimi regolatori non seguono la cinetica MM.

Regolazione enzimatica

Per modulare la velocità con la quale metaboliti vengono sintetizzati o demoliti, si deve avere una regolazione dell'attività enzimatica, in cui i protagonisti sono i cosiddetti enzimi regolatori, che non seguono la cinetica di MM. Un meccanismo importante di regolazione enzimatica riguarda la compartimentalizzazione cellulare negli eucarioti: infatti, il fatto che determinate vie metaboliche si svolgano in compartimenti diversi è utile per evitare che lo stesso metabolita vada in vie metaboliche diverse: questo ci permette di massimizzare la funzione ed evitare conflitti tra enzimi. La presenza di enzimi regolatori, inoltre, è di fondamentale importanza. Gli enzimi regolatori sono proteine che possiedono più siti di legame per molecole diverse: avranno un sito attivo, in grado di legare il substrato che poi verrà convertito in prodotto, e un sito allosterico, in grado di legare un effettore allosterico che può modulare la funzionalità dell'enzima. L'effettore allosterico può avere un effetto di attivazione o inibizione dell'enzima.