Biochimica

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Amminoacidi

Sono unità monomeriche che rappresentano l’unità strutturale delle proteine. Sono costituiti da un gruppo carbossilico (-COOH), un gruppo amminico (-NH₂), un gruppo R e un atomo di idrogeno legati allo stesso atomo di carbonio alfa, che è dunque un centro chirale (in tutti gli AA tranne che nella glicina poiché il gruppo R è un H) e asimmetrico; perciò, può dare origine a stereoisomeri (atomi legati allo stesso modo che differiscono nel modo in cui sono orientati nello spazio). Infatti, tra gli amminoacidi si hanno due forme stereoisomere, in particolare due enantiomeri (speculari) definiti D e L; in natura gran parte degli AA hanno una stereoselettività, ovvero presentano soltanto la configurazione L (NH₂ a sx), anche se in alcuni batteri possiamo trovare anche la configurazione D.

Tutti gli AA L hanno configurazione assoluta S, dove il sostituente con priorità più bassa a seconda del numero atomico (H) viene posto lontano dall’osservatore; tranne la cisteina che ha configurazione R in quanto il gruppo R dov’è presente l’atomo di zolfo ha priorità maggiore rispetto al gruppo COOH.

Ad eccezione della glicina, tutti gli amminoacidi sono otticamente attivi, ovvero ruotano il piano di luce polarizzata, la direzione e l’angolo di rotazione possono essere misurati da un polarimetro.

Si conoscono 150 amminoacidi, ma nelle proteine sono presenti solo 20 tipi di AA che variano di dimensioni, carica, capacità di formare legami idrogeno e reattività chimica. Tutte le proteine di ciascuna specie (batteri, archeobatteri, eucarioti) vengono costruite a partire dagli stessi 20 AA, che formano legami covalenti.

Il gruppo carbossilico e quello amminico sono caratterizzati da una propria pK_a (costante di associazione acida) rispettivamente circa 2 e 9.

Il gruppo amminico ha natura basica mentre quello carbossilico ha natura acida, perciò, a causa della natura opposta dei due gruppi funzionali essi si neutralizzano reciprocamente. Ecco perché in una soluzione a pH neutro gli amminoacidi esistono sotto forma di ioni dipolari (zwitterioni), dove il gruppo amminico è protonato (NH₃⁺) e il gruppo carbossilico è deprotonato (COO^-).

pK_a = −10 LogKa = pH + Log [AH]\[A−][AH]

Se pK_a = pH = Log = 0 equilibrio −[A ][AH]

Se pK_a > pH = Log > 0 prevale la forma protonata −[A ][AH]

Se pK_a < pH = Log < 0 prevale la forma deprotonata −[A ]

Per ogni AA i due gruppi funzionali NH₂ e COOH possono essere ionizzabili.

La titolazione acido-base comporta la graduale aggiunta o rimozione di protoni o di gruppi funzionali ionizzabili. In soluzione acida il gruppo carbossilico è protonato (COOH) e il gruppo amminico è ionizzato (NH₃⁺). Aggiungendo una base il pH aumenta e il gruppo carbossilico è il primo a cedere un protone, poiché ha pK_a = 2 (deprotonato), mentre il gruppo amminico rimane protonato.

→ forma zwitterionica. La forma dipolare persiste fino a pH = 9, quando il gruppo amminico inizia a cedere un protone (deprotonato) mentre il gruppo carbossilico rimane deprotonato. 1

Punto isoelettrico

La carica positiva (legata al gruppo amminico) e la negativa (legata al gruppo carbossilico) si neutralizzano cosicché l’amminoacido ha una carica netta pari a zero. Il valore del pH in cui la carica netta è uguale a 0 è detto punto isoelettrico (PI), il quale dipende dalle costanti di dissociazione dei gruppi funzionali: a valori di pH inferiori a quelli del punto isoelettrico l’amminoacido avrà una carica netta positiva, mentre a valori di pH superiori al punto isoelettrico avrà una carica netta negativa. Per un amminoacido avente una catena laterale non ionizzabile, il valore del pI è determinato dalla media aritmetica dei valori della pK_a di ciascuno dei due gruppi funzionali → (alanina). 3 = + 2

Per gli amminoacidi con catena laterale ionizzabile si utilizzano i due pK più bassi per gli AA acidi e i due pK più alti per gli AA basici: + =

AA acidi (R con carica negativa a pH fisiologico) → - 23+ =

AA basici (R con carica positiva a pH fisiologico) → - 2

Arginina, lisina e istidina hanno carica positiva, quindi prenderemo in considerazione i pK più alti del C alfa e della catena laterale e facendo la media di questi pK otterremo il pI; il contrario vale per l’acido glutamminico e aspartico che hanno un pI distante dal pH fisiologico; tuttavia, dal momento in cui il pH si porterà vicino al pI non avranno più carica negativa.

• L’alanina ha un pI = 6, quindi molto vicino al pH, in cui l’amminoacido assume una carica neutra, ma in una soluzione tampone a pH > 10 o < 2 l’amminoacido avrà rispettivamente una carica negativa e una carica positiva.
• L’acido aspartico ha un pH = 2.8 per il quale l’amminoacido assumerà una carica neutra perché si trova in una condizione in cui le cariche si annullano ma ad un pH fisiologico avrà una carica negativa.
• L’arginina ha un pH = 10.7 per il quale l’amminoacido assumerà una carica neutra, ma ad un pH fisiologico avrà una carica positiva.

Elettroforesi = metodo di separazione di amminoacidi basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle cariche.

Modalità d’uso: una piccola quantità dell'aminoacido, viene posta vicino al centro della striscia di matrice (carta filtro, gel di policrilamide, carta di acetato di cellulosa) ed un potenziale elettrico viene applicato alle estremità di tale striscia.

Gli amminoacidi con netta carica negativa, una volta applicato il potenziale elettrico, emigreranno verso l’anodo (parte positiva), quelli con carica positiva verso il catodo. Gli AA con netta carica nulla resteranno nella loro posizione attuale.

Classificazione

Gli amminoacidi possono essere classificati in base al loro gruppo R:

• Gruppo R non polare → gli amminoacidi formano interazioni idrofobiche → catene laterali composte da idrocarburi alifatici (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina) o aromatici (fenilalanina, triptofano) che non creano legami idrogeno con l’acqua.
• Gruppo R privo di carica → gli amminoacidi sono polari e formano legami H → gruppi idrofilici che si legano all’acqua. La polarità della serina e della treonina è dovuta al loro gruppo ossidrilico (OH), dell’asparagina e glutammina al carbossamide (O=C-NH₂, gruppo ammidico sulla catena laterale), della cisteina al gruppo solfidrico o tiolico (SH legato alla catena laterale). Dall’ossidazione di due residui di cisteina si può formare un legame (o ponte) disolfuro.
• Gruppo R con carica positiva a pH fisiologico (basico) → gli amminoacidi sono carichi positivamente e formano legami ionici, hanno una catena laterale con PK>PH → lisina (gruppo amminico), arginina (gruppo guanidinico) che vengono chiamati diamminomonocarbossilici e l’istidina (gruppo imidazolico).
• Gruppo R con carica negativa a pH fisiologico (acido) → gli amminoacidi sono carichi negativamente e formano legami ionici, hanno una catena laterale con PK < PH → aspartato e glutammato (gruppo carbossilico) che vengono chiamati monoammino-dicarbossilici.

Gli amminoacidi possono distinguersi in:

• AA essenziali → organismi superiori come l’uomo non riescono a sintetizzarli, deve assumerli dall’esterno tramite l’alimentazione.
• AA non essenziali → l’uomo può sintetizzarli.
• AA semi-essenziali → l’organismo umano può sintetizzarli ma dipendono comunque da quelli essenziali.

Ruolo

Il ruolo principale degli amminoacidi è quello della sintesi delle proteine, tuttavia ci sono altre funzioni: vengono utilizzati per ottenere energia (non la via migliore, l’uomo infatti deve eliminare sostanze che possono essere nocive all’interno dello stesso amminoacido), possono fungere da messaggeri chimici per la comunicazione tra cellule (neurotrasmettitori), sono potenti mediatori delle risposte allergiche (istidina).

Dagli amminoacidi alle proteine

Gli amminoacidi sono uniti tra loro e formano le catene polipeptidiche (proteine). Le proteine sono polimeri lineari formati dall’unione del gruppo alfa-carbossilico di un amminoacido con il gruppo alfa-amminico libero di un altro amminoacido attraverso un legame covalente tra N e C definito legame peptidico (detto anche legame carboamidico) tramite l’eliminazione dell’acqua = condensazione, al contrario se si aggiunge l’acqua si scinde il legame peptidico e questa reazione viene chiamate idrolisi, che è una reazione spontanea e favorita ma molto lenta, perciò può avvenire solo attraverso un catalizzatore o con condizioni fisiologiche diverse di pH e T.

Il legame peptidico è un ibrido di risonanza, ovvero il legame tra C e N non è né singolo né doppio, questo perché c’è una delocalizzazione degli elettroni dell’unità peptidica. A causa del fenomeno di risonanza si crea un dipolo di carica e le cariche parziali, rispettivamente negativa e positiva, sull’ossigeno e sull’azoto del legame, rendono tali atomi particolarmente disponibili a formare legami idrogeno, i quali potranno stabilizzare la struttura secondaria delle proteine.

Il legame peptidico è un legame polare perché i 4 atomi CO-NH giacciono tutti nello stesso piano grazie alla rigidità di C e N. La relazione di complanarità degli atomi del gruppo ammidico è sottolineata da un piano immaginario ombreggiato, che giace tra due carboni α successivi nello scheletro peptidico. Tale caratteristica impedisce la rotazione intorno al legame peptidico C-N; tuttavia, è possibile libera rotazione tra il C alfa di ciascun amminoacido con il carbonio carbonilico dell’amminoacido che precede e con l’azoto ammidico dell’amminoacido che segue: gli angoli di rotazione intorno a questi legami sono designati rispettivamente ψ (psi) e Ф (fi). Questa libertà di rotazione permette alle proteine di ripiegarsi in diversi modi assumendo diverse conformazioni geometriche per l’acquisizione della corretta struttura tridimensionale, ma non tutte le combinazioni sono possibili, a causa dell’impedimento sterico dei gruppi peptidici e delle catene laterali.

Il legame peptidico si trova principalmente nella forma trans, in cui due atomi di C alfa si trovano in posizione opposta rispetto al legame peptidico; tuttavia, si può trovare anche nella forma cis, dove il C alfa del primo amminoacido e quello del secondo stanno nello stesso lato, ciò però crea un ingombro sterico. 3

Struttura primaria delle proteine

Ogni proteina di un organismo è dotata di una sequenza (catena) definita che costituisce la sua struttura primaria.

Una catena peptidica è costituita da strutture lineari derivanti dall’unione di AA. Consiste di una parte che si ripete regolarmente, detta catena principale o scheletro covalente, e di una parte variabile, che comprende le catene laterali caratteristiche di ciascun amminoacido.

È determinata solo da legami covalenti come il legame peptidico e i legami disolfuro che possono unire tra loro differenti catene o diverse parti della stessa catena. Per convenzione, una catena peptidica inizia con l’amminoacido N-terminale, avente cioè il gruppo NH₃⁺ libero e termina con l’amminoacido C-terminale o carbossi-terminale, ossia con il gruppo carbossilico libero.

Ciascuna proteina si differenzia per la sequenza e la lunghezza degli amminoacidi.

In base alla sequenza della catena peptidica possiamo definire:

• Peptidi (2-10 amminoacidi) → Dipeptidi (unione di 2 aminoacidi) come l’Aspartame (dolcificante sostituto del saccarosio); Tripeptidi (unione di 3 amminoacidi) come il Glutatione (GSH) costituito da cisteina e glicina, legate da un normale legame peptidico e glutammato, che invece è legato alla cisteina con un legame peptidico atipico tra il gruppo carbossilico della catena laterale del glutammato e il gruppo amminico della cisteina (ruolo antiossidante).
• Oligopeptidi (11-19 amminoacidi).
• Polipeptidi (20-100 amminoacidi).
• Proteine (+100 amminoacidi).

Per ciascun amminoacido costituente la catena polipeptidica si presentano 20 diverse possibilità di catena laterale (o residui), per cui le possibili strutture primarie sono infinite. La maggior parte delle catene polipeptidiche naturali è costituita da un numero di residui amminoacidici che varia da 10 a 2000.

I residui più abbondanti sono la Leu, Ala, Gly, Val, Glu, e Ser. Più rari sono la il Trp, Cys, Met, His.

Alterazioni della struttura primaria di una proteina (sostituzione anche di un solo residuo amminoacidico) ne possono alterare drasticamente la funzionalità e provocare malattie come la fibrosi cistica (modifiche nella sequenza AA di una proteina situata sulla membrana cellulare delle cellule epiteliali) e l’anemia falciforme (modifiche nella sequenza dell’emoglobina).

Struttura secondaria delle proteine

La struttura secondaria descrive l’organizzazione spaziale stabile degli amminoacidi in motivi strutturali ricorrenti.

Strutture polipeptidiche regolari e periodiche

• Alfa-elica → Lo scheletro carbonioso polipeptidico si avvolge attorno ad un asse immaginario a formare un’elica destrogira (senso orario) e regolare. I gruppi R sporgono fuori dallo scheletro elicoidale.

L’α-elica è stabilizzata da legami idrogeno tra gruppi N-H e C=O di differenti legami peptidici. Mentre i legami idrogeno sono nella direzione dell’asse dell’elica, le catene laterali si estendono verso l’esterno con un andamento a spirale.

Gli angoli di torsione per ottenere un’elica di questo tipo sono φ=-60°, ψ tra -45 e -50°.

Per ogni spira ci sono 3,6 amminoacidi (n) (equivalente a 13 atomi (N) e si dice anche elica 3.613) e tra 2 spire successive c’è una distanza di circa 5,4 Amstrong.

Il gruppo C=O di ciascun amminoacido è unito da un legame idrogeno al gruppo N-H dell’amminoacido che si trova 4 residui più avanti nella sequenza lineare (i+4).

La sequenza amminoacidica influenza la stabilità dell’alfa elica. Non tutti i polipeptidi possono formare alfa elica stabili.

Non tutti gli amminoacidi hanno la stessa propensione a formare alfa eliche e ciò dipende dal residuo R. AA con catena laterale poco ingombrante (es. Ala) tendono a formare più facilmente questo tipo di struttura mentre la prolina e la glicina hanno una bassa propensione. 4

È importante la posizione di un amminoacido rispetto agli amminoacidi adiacenti poiché le interazioni tra le catene laterali possono stabilizzare o destabilizzare la struttura alfa-eliche.

• Eliche alternative → Esistono anche altri tipi di eliche nelle proteine, stabilizzate da legami idrogeno. Normalmente queste eliche sono meno frequenti e/o più corte dell’α-elica.

L’elica 3 10 contiene 3 residui per giro (con 10 atomi per giro, facendo legami idrogeno tra carbonili e idrogeni ammidici residui distanti 3 residui lungo la catena).

Altre strutture ad elica sono il nastro 27 (legami idrogeno tra carbonile e azoto ammidico distanti 2 residui lungo la catena) e l’elica π, che ha 4.4 residui per giro (e 16 atomi) per cui è anche detta elica 4.416 (legami idrogeno tra carbonile e azoto ammidico distanti 5 residui lungo la catena).

Esistono anche eliche levogire (senso di avvitamento antiorario).

• Beta-foglietto → È un’altra struttura secondaria stabile e molto diffusa delle proteine.

Ogni foglietto beta è formato da due o più catene beta polipeptidiche disposte una a fianco all’altra, estese e ripiegate «a fisarmonica» con gruppi R rivolti verso l’esterno. Sono unite da legami H perpendicolari allo scheletro tra l’ossigeno di un C=O di un legame peptidico e il gruppo N-H di un altro legame peptidico appartenente ad un filamento diverso.

In un foglietto beta-ripiegato le catene polipeptidiche possono avere la stessa direzione (foglietti beta-paralleli) o la direzione opposta (foglietti beta-antiparalleli).

Un foglietto beta può essere formato anche da una singola catena polipeptidica ripiegata su sé stessa: in tal caso i legami a H sono legami intracatena.

Nelle rappresentazioni schematiche i foglietti b sono generalmente raffigurati da frecce larghe rivolte nella direzione del carbossi-terminale in modo da identificare se la struttura è parallela o antiparallela.

Gli angoli di torsione per ottenere un’elica di questo tipo sono φ= -150 e -100° e ψ tra +120 e +160°.

Strutture polipeptidiche secondarie non regolari e non periodiche

• Ripiegamento beta (o beta-turn) → È una struttura non ripetitiva né casuale responsabile dei cambiamenti di direzione delle catene polipeptidiche. Collega le estremità di due segmenti adiacenti aventi strutture ad alfa-elica o a foglietto beta-ripiegato ed è stabile grazie a legami H tra il gruppo carbonico del primo residuo e il gruppo amminico del quarto residuo. Certi amminoacidi, come la Pro o la Gly compaiono spesso nei βturn e la conformazione del ripiegamento dipende dalla sua composizione amminoacidica.
• Anse → Sono strutture flessibili apparentemente disorganizzate che consentono cambi di direzione e collegamenti tra strutture alfa e beta.

Struttura terziaria delle proteine

La struttura terziaria rappresenta la conformazione tridimensionale avvolta di una proteina ed è determinata dalla struttura primaria di una cate